2.3.4.1.Khảnăng bắt gốc tự do DPPH
- Nguyên tắc: Khảnăng bắt gốc tự do DPPH được xác định dựa vào phương pháp của Francine M.B, et al[59].DPPH có khảnăng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch MeOH bão hòa. Khi cho mẫu vào hỗn hợp, nếu có mặt chất có khảnăng làm trung hòa hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxy hóa được xác định khi đo phổ UV, thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng đọc trên máy so màu ởbước sóng 517 nm.
40
Hình 2.5. Cơ chế phản ứng của quét gốc tự do DPPH
- Tiến hành:
+ Bổ sung 1,5ml dung dịch DPPH 0,02mg/ml (0,002g DPPH trong 100ml methanol) vào mỗi lọ tối màu chứa 0,75ml mật ong 0,1 g/ml.
+ Lắc đều hỗn hợp
+ Cho dung dịch vào tủ tối, tránh ánh sáng, ủ trong vòng 30 phút.
+ Đo Abs tại bước sóng 517nm với mẫu trắng là metanol - Xử lý kết quả
Khảnăng bắt gốc tự do của dịch chiết được tính bằng công thức:
𝑅𝑆𝐴% = (𝐴𝑐ℎứ𝑛𝑔− 𝐴𝑚ẫ𝑢
𝐴𝑐ℎứ𝑛𝑔 ) ∗ 100
Trong đó:
RSA%: Khảnăng bắt gốc tự do của mật ong (%)
𝐴𝑚ẫ𝑢:Độ hấp thụ A của ống DPPH chứa dịch chiết
𝐴𝑐ℎứ𝑛𝑔: Độ hấp thụ A của ống DPPH chứa mẫu kiểm chứng âm (methanol)
100: hệ số chuyển đổi sang %
2.3.4.2.Xác định hàm lượng tổng phenolic
- Nguyên tắc: Hàm lượng tổng phenolic được xác định dựa vào phương pháp của Francine M.B, et alvà có chỉnh sửa[59]. Các polyphenol trong dịch chiết được xác định bằng đo màu, dùng thuốc thử Folin-Ciocalteu. Thuốc thử này chứa chất oxi hóa là axit phospho-vonframic, trong quá trình khử, các nhóm hydroxy phenol dễ bị oxi hóa, chất oxi hóa này sinh ra màu xanh có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 760 nm. Phản ứng này là do sự hình thành màu xanh của vonfarm và molypden. Các thuốc thử Folin-Ciocalteu phản ứng với nhiều hợp chất polyphenol và mặc dù có thểcó đáp ứng khác nhau với các hợp chất đơn lẻ, thì việc lựa chọn
41 axit gallic (GAE) làm chất chuẩn hiệu chuẩn cũng giúp ích cho việc thu được dữ liệu polyphenol tổng số.
- Tiến hành:
❖Dựng đường chuẩn axit gallic
+ Pha dung dịch axit gallic theo nồng độ: 5; 100; 200; 500; 1000 µg/ml
+ Thêm 0,2 ml dung dịch axit gallic lần lượt theo các nồng độ cùng với 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu 1:10 vào lọ tối màu
+ Hỗn hợp được đểyên trong 5 phút sau đó đuợc
+ Thêm thêm 0,8ml Na2CO3 7,5% (w/v).
+ Để dung dịch trong bóng tối 75 phút trước khi tiến hành đo.
+ Đo độ hấp thụAbs đo bởi máy đo quang UV-VIS tại 760nm với mẫu trắng được chuẩn bị tương tựnhưng thay mẫu thử bằng metanol
+ Từđó xác định được đường chuẩn
❖Tiến hành xác định:
+ Thêm 0,2ml mật ong đã pha loãng với nồng độ 0,1g/ml cùng với 1ml thuốc thử Folin pha loãng tỷ lệ 1:10 vào lọ tối màu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Hỗn hợp được đểyên trong 5 phút sau đó đuợc thêm thêm 0,8ml Na2CO3
7,5% (w/v).
+ Để dung dịch trong bóng tối 75 phút trước khi tiến hành đo
+ Đo độ hấp thụAbs đo bởi máy đo quang UV-VIS tại 760nm với mẫu trắng được chuẩn bị tương tựnhưng thay mẫu thử bằng metanol
+ Đường chuẩn acid gallic (5–1000 µg/ml) được sử dụng làm chất chuẩn tham chiếu.
- Xử lý kết quả:
+ Hàm lượng polyphenol tổng được biểu thị bằng miligram đương lượng acid gallic trên 1 kg mật ong (mg GAE/ kg mật ong) và được tính theo công thức:
𝑇𝑃𝐶 = 𝑎 ∗ 𝑉
10 ∗ 𝑚 (m𝑔
𝐺𝐴𝐸
100𝑔𝑚ậ𝑡 𝑜𝑛𝑔)
Trong đó:
TPC: Hàm lượng Polyphenol tổng (mg GAE/ 100g mật ong)
a: Hàm lượng acid gallic tương đương xác định từđường chuẩn (µg/ml) V: Thể tích mật ong (ml)
42 m: Khối lượng mật ong (g)
2.3.4.3.Xác định hàm lượng tổng flavonoid
- Nguyên tắc: Hàm lượng tổng flavonoid được xác định dựa vào phương pháp của Francine M.B, et al và có chỉnh sửa [59].Dựa vào tính chất tạo phức màu rất mạnh của các flavonoid với kim loại. Ion Al3+thường được sử dụng vì nó tạo phức màu mạnh và không độc hại. Khi cho dịch chiết flavonoid tác dụng với AlCl3, Al3+ sẽ thay thế các H+ở các nhóm -OH liền kề hoặc cách nhau 1C tạo liên kết O- Al-O tạo thành phức có màu. Quercetinđược chọn làm chất chuẩn hiệu chuẩn để thu thập được kết quả flavonoid tổng.
Hình 2.6. Cơ chế phản ứng của flavonoid với AlCl3
- Tiến hành:
❖Dựng đường chuẩn quercetin
+ Pha dung dịch quercetin theo nồng độ: 0; 50; 100; 150; 200; 250 µg/ml
+ 2ml dung dịch quercetin được trộn với 2ml Al2CO3 2% trong lọ tối màu
+ Để dung dịch trong bóng tối 15 phút trước khi tiến hành đo
+ Đo Abs bằng máy đo UV-VIS tại bước sóng 415nm với mẫu trắng metanol
+ Từđó các định đường chuẩn
❖Tiến hành xác định
+ 2ml dung dịch mật ong 0,3g/ml được trộn với 2ml Al2CO3 2% trong lọ tối màu
+ Để dung dịch trong bóng tối 15 phút trước khi tiến hành đo
+ Đo Abs bằng máy đo UV-VIS tại bước sóng 415nm với mẫu trắng metanol
+ Đường chuẩn quercetin (0–250 µg/ml) được sử dụng làm chất chuẩn tham chiếu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
43 Hàm lượng flavonoid tổng được biểu thị bằng miligram đương lượng quercetin trên 100 mật ong (mg QE/ 100g mật ong) và được tính theo công thức:
𝑇𝐹𝐶 = 𝑎 ∗ 𝑉
10 ∗ 𝑚
Trong đó:
TFC: Hàm lượng flavonoid tổng (mg QE/ 100g mật ong)
a: Hàm lượng quercetintương đương xác định từđường chuẩn (µg/ml) V: Thể tích mật ong (ml)
m: Khối lượng mật ong (g)