- Máy quang phổ đo màu sắc Colorlite sph860
- Khúc xạ kế với đo độ Brix 45–93% - Máy UV - VIS - Đũa thủy tinh - Cốc thủy tinh 50ml - Nồi cách thủy - Bếp điện - Cân phân tích - Đồng hồ bấm giây - Bình tam giác 250 ml - Bình định mức 100 ml
- Buret dung tích 25ml, chia độ đến 0,1 ml
- Pipet chia vạch, dung tích 0,5; 1; 5; 10 ml
- Ống đong chia vạch, dung tích 100 ml - Bình lọc hút chân không - Giấy lọc mịn - Ống nghiệm - Vontex - Đĩa petri - Que cấy - Đèn cồn - Bình xịt cồn
33 - Đầu côn - Micropipet - Ống fancol - Ống eppendorf - Nồi tiệt trùng - Tủ an toàn sinh học - Tủ nuôi cấy - Đĩa 96 giếng - Lọ tối màu 2.2.2 Hóa chất - NaOH - H2SO4 - KMnO4 - Dung dịch pheling A - Dung dịch pheling B - Fe2(SO4)3 - HCl - Phenolphtalein 1% trong cồn 600 hoặc metyl da cam. - Iôd (I2) loại tinh khiết phân
tích - KI
- CH3COONa.3H2O
- Axit axetic băng CH3COOH - Natri clorua NaCl
- Tinh bột tan. - K4Fe (CN6).3H2O
- Zn (CH3COO)2.2H2O - NaHSO3
- Cồn
- Môi trường Nutrient Broth - Nước muối sinh lý 0,90% - Môi trường Mueller-Hinton
broth
- Môi trường Mueller Hinton Agar - Metanol - 2,2-Diphenyl-1- picrylhydrazylDPPH - Folin-Ciocalteu - Axit gallic - Na2CO3 - AlCl3 - Quercetin 2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Đo màu của mẫu mật ong
Nguyên tắc: Màu sắc của mật ong được đo trên máy quang phổđo màu sắc theo phương pháp của Olga Escuredo[49]. Từ số liệu đo được, qua xử lý, so sánh trên thang đo pfund đểtìm được màu của mật ong.
Nguyên lý của máy quang phổđo màu sắc: nguyên lý máy đo màu quang phổ là do hiện tượng phản xạ ánh sáng, nguồn sáng tới là ánh sáng trắng bao gồm các tia sáng đơn sắc với những bước sóng khác nhau từđỏđến tím chiếu vào vật thể cần quan sát. Sau đó tia sáng phản xạ lại mắt người là tia sáng có màu nào thì người quan sát sẽ nhìn ra vậy có màu sắc như thế. Về sắc màu được sử dụng để phân biệt
34 vềmàu đỏ, vàng, xanh,... Về giá trịmàu là độ sáng hay tối của một màu còn về sắc độđo sự khác biệt của một mày như thế nào là so với màu xám. Cả 3 nhân tố của màu sắc này có thểđược kết hợp biểu diễn bằng đồ thị và được kết hợp trong hệ thống không gian 3 chiều gọi là không gian màu.
- Tiến hành:
+ Lấy 5ml mật ong cho vào cốc thủy tinh rồi tiến hành dùng máy quang phổ đo màu sắc đểđo
+ Ghi lại số liệu L, a, b
+ Tính toán, rồi so kết quả với bảng màu pfund để tìm ra màu của mật ong - Xử lý số liệu 2 2 C a b b H arctan a = + = [49] mmPfund= −0,631* L+0,84 * C−1,026 * H+155,89[50] Trong đó: L cho độ sáng (từđen sang trắng)
a (từ xanh lá sang đỏ)
b (từ xanh dương sang vàng)
Tọa độ C (sắc độ hoặc độbão hòa tương đối) H (góc Hue)
35
Bảng 2.2. Đánh giá, xếp loại màu sắc của mật ong [51]
Tiêu chuẩn
màu USDA Dải màu theo tiêu chuẩn màu của USDA Phạm vi màu Pfund(milimet)
Trắng trong Mật ong có màu trắng trong hoặc nhạt hơn 8 hoặc nhỏhơn Cực trắng Mật ong đậm hơn trắng trong, nhưng không (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đậm hơn cực trắng về màu sắc
Trên 8 và bao gồm cả 17 Trắng Mật ong đậm hơn cực trắng, nhưng không
đậm hơn trắng có màu
Trên 17 và bao gồm cả 34 Hổ phách cực
trong
Mật ong đậm hơn Trắng, nhưng không đậm hơn hổ phách cực trong
Trên 34 và bao gồm cả 50 Hổ phách
trong
Mật ong đậm hơn hổ phách cực trong, nhưng không đậm hơn hổ phách trong
Trên 50 và bao gồm cả 85 Hổ phách Mật ong đậm hơn màu hổ phách trong,
nhưng không đậm hơn màu Hổ phách
Trên 85 và bao gồm cả 114 Sẫm Mật ong đậm hơn màu hổ phách Trên 114
Hình 2.2. Thang đo Pfund
2.3.2 Xác định các chỉ tiêu hóa lý của mật ong
36 - Xác định hàm lượng nước theo TCVN 5263:1990[52]
- Xác định hàm lượng đường khử tự do theo TCVN 5266:1990[53] - Xác định hàm lượng đường saccharose theo TCVN 5269:1990[54] - Xác định độ axit theo TCVN 5271:1990[55]
- Xác định hoạt lực diataza theo TCVN 5268:1990[56]
- Xác định hàm lượng 5 - Hyđroxymetylfurfural (5-HMF) theo TCVN 5270:1990 [57]
2.3.3 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của mật ong
2.3.3.1.Xác định đường kính của vòng tròn kháng khuẩn
- Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp khuếch tán đĩa Kirby-Bauer [58] có chỉnh sửa. Khi mẫu được áp lên đĩa thạch chứa vi khuẩn, các đĩa sẽ hấp thụ một lượng vừa đủnước để hòa mật ong, sau đó khuếch tán vào môi trường. Trong giai đoạn logarit, vi khuẩn trên mặt đĩa thạch nhân lên nhanh hơn so với sự khuếch tán của mật ong. Các tế bào vi khuẩn không bịức chế tiếp tục nhân lên đến khi sự phát triển nhìn thấy bằng mắt thường. Không xuất hiện sựtăng trưởng nếu như mật ong trở thành chất ức chế. Đường kính của vòng tròn kháng khuẩn tỉ lệ thuận với độ nhạy cảm của vi khuẩn [28].
- Tiến hành:
+ Chuẩn bịmôi trường
• Môi trường NB với 8g/1000ml: Pha môi trường với tỉ lệ trên rồi bổ sung thêm agar (15-20g/l), sau đó đem tiệt trùng ở 121±20C trong 1h. Đổ môi trường trong tủ hút với thể tích 15-20 ml môi trường/ đĩa petri
• Nước muối 0,9%: Đem tiệt trùng ở 121±20Ctrong 1h
+ Chuẩn bị vi khuẩn:
• Cho chủng vi khuẩn được cấy từ đĩa thạch vào ống fancol có chứa 5ml NaCl 0,90%
• Đem ống fancol chứa mẫu vi khuẩn trên đi đo Abs với mẫu kiểm chứng là NaCl 0,90% tại bước sóng 600nm
• Pha loãng dịch vi khuẩn đểđạt được nồng độ 106 cfu/ml (với Abs = 0,10 tương đương với nồng độ vi khuẩn là 108 cfu/ml)
+ Xác định (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
37
• Dùng micropipet hút 100 µl dịch vi khuẩn đã được chuẩn bị cho vào đĩa thạch
• Dùng tăm bông đã được tiệt trùng, chang đều dịch vi khuẩn trên bề mặt thạch của hộp petri
• Dùng đầu côn với đường kính 8mm để tạo ra các giếng trên đĩa thạch
• Nhỏ 100 µl dịch mật ong vài các giếng đã tạo trên
• Đem nuôi cấy ở 370C trong 24h - Xử lý kết quả
+ Sau khi nuôi cấy, trên mặt thạch sẽ xuất hiện các vòng tròng kháng khuẩn (vị trí xung quanh giếng đã nhỏ dịch mẫu và không có vi khuẩn mọc lên)
+ Đo đường kính vòng tròn kháng khuẩn đó. Đường kính của vòng tròn kháng khuẩn tỉ lệ với mức độ kháng khuẩn của mẫu mật ong.
2.3.3.2.Xác định nồng độ kháng khuẩn tối thiểu - MIC
- Nguyên tắc: Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu được xác định bằng phương pháp pha loãng theo Mohd I. Z, et al, có chỉnh sửa[46]. Mẫu mật ong được cho vào các giếng ở các nồng độ khác nhau cùng vi khuẩn và môi trường MHB. Hoạt tính kháng khuẩn trong mật ong sẽức chế sự phát triển tạo khuẩn lạc của vi khuẩn, làm cho dung dịch không bị đục. Sau 24h nuôi cấy, tại nồng độ mật ong nào mà mắt thường nhìn thấy rõ sự ức chế của mẫu đối với vi khuẩn (so với mẫu kiểm chứng) thì tại đó là nồng độ kháng khuẩn của mẫu đối với vi khuẩn đó.
- Tiến hành
+ Chuẩn bị môi trường:
• Môi trường MHB: 21g/1000ml. Pha theo tỉ lệ cần thiết rồi đem tiệt trùng ở 121±2oC trong 1h
• Nước muối 0,9%: Đem tiệt trùng ở 121±2oC trong 1h
+ Chuẩn bị vi khuẩn: Giống với sự chuẩn bị ở phần làm vòng tròn kháng khuẩn
+ Chuẩn bị mẫu
• Đối với một mẫu mật ong, ta pha loãng ởnăm nồng độ khác nhau với môi trường MHB
• Dùng vontex đểđồng nhất mật ong và môi trường MHB
38
• Đĩa 96 giếng được tráng bằng cồn 96o, sau đó để khô
• Dùng micropipet lấy 180µl hỗn hợp mẫu mật ong, môi trường và 20µl dịch vi khuẩn cho vào các giếng theo thứ tự
• Mẫu KCm là giếng chỉ chứa 180µl hỗn hợp mẫu mật ong, môi trường
▪ Mẫu KCVK là giếng chứa 180µl môi trường MHB và 20µl dịch vi khuẩn
• Đậy nắp đĩa lại và đem nuôi cấy ở 37oC trong 24h
Hình 2.3. Quy trình tiến hành MIC [16]
- Xử lý kết quả: Tại nồng độ nhỏ nhất nào của mật ong mà mắt thường nhìn thấy rõ sự vẩn đục của giếng - sựức chế của mẫu đối với vi khuẩn (so với mẫu kiểm chứng) thì tại đó là nồng độ kháng khuẩn của mẫu đối với vi khuẩn đó.
2.3.3.3.Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu – MBC
-Nguyên tắc: Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu – MBC thực hiện theo phương pháp của Mohd I.Z,et al, có chỉnh sửa [46].Hỗn hợp dung dịch mật ong, môi trường, vi khuẩn ở giếng MIC được cấy vào đĩa petri. Vi khuẩn ở dịch cấy nào mọc lên thì dịch mật ong tại nồng độ đó không tiêu diệt được vi khuẩn. Nồng độ nhỏ nhất mà tại đó vi khuẩn không mọc lên thì đó là nồng độ diệt khuẩn của mẫu mật ong đối với loại vi khuẩn đang nghiên cứu[28].
- Tiến hành
+ Chuẩn bịmôi trường: Môi trường MHA (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
• Pha môi trường MHA với tỉ lệ 38g/1000ml
39
• Đổmôi trường trong tủ hút với thể tích 15-20 ml môi trường/ đĩa petri
+ Xác định
• Chia đĩa petri thành 8 phần và đánh số tương ứng với 8 giếng trên 1 cột của đĩa 96 giếng
• Dùng micropipet lấy 10µl dịch từ các giếng và nhỏ giọt tròn lên từng phần đã được đánh sốtương ứng.
• Đem nuôi cấy ở 37oC trong 24h
Hình 2.4. Đĩa petri cấy làm MBC
- Xử lý kết quả: Sau khi nuôi, phần nào không mọc lên khuẩn lạc thì tại nồng độđó đã diệt vi khuẩn. Nồng độ nhỏ nhất diệt được vi khuẩn là nồng độ diệt khuẩn của loại mật ong đó với mẫu vi khuẩn nghiên cứu.
2.3.4 Xác định hoạt tính chống oxi hóa của mật ong
2.3.4.1.Khảnăng bắt gốc tự do DPPH
- Nguyên tắc: Khảnăng bắt gốc tự do DPPH được xác định dựa vào phương pháp của Francine M.B, et al[59].DPPH có khảnăng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch MeOH bão hòa. Khi cho mẫu vào hỗn hợp, nếu có mặt chất có khảnăng làm trung hòa hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxy hóa được xác định khi đo phổ UV, thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng đọc trên máy so màu ởbước sóng 517 nm.
40
Hình 2.5. Cơ chế phản ứng của quét gốc tự do DPPH
- Tiến hành:
+ Bổ sung 1,5ml dung dịch DPPH 0,02mg/ml (0,002g DPPH trong 100ml methanol) vào mỗi lọ tối màu chứa 0,75ml mật ong 0,1 g/ml.
+ Lắc đều hỗn hợp
+ Cho dung dịch vào tủ tối, tránh ánh sáng, ủ trong vòng 30 phút.
+ Đo Abs tại bước sóng 517nm với mẫu trắng là metanol - Xử lý kết quả
Khảnăng bắt gốc tự do của dịch chiết được tính bằng công thức:
𝑅𝑆𝐴% = (𝐴𝑐ℎứ𝑛𝑔− 𝐴𝑚ẫ𝑢
𝐴𝑐ℎứ𝑛𝑔 ) ∗ 100
Trong đó:
RSA%: Khảnăng bắt gốc tự do của mật ong (%)
𝐴𝑚ẫ𝑢:Độ hấp thụ A của ống DPPH chứa dịch chiết
𝐴𝑐ℎứ𝑛𝑔: Độ hấp thụ A của ống DPPH chứa mẫu kiểm chứng âm (methanol)
100: hệ số chuyển đổi sang %
2.3.4.2.Xác định hàm lượng tổng phenolic
- Nguyên tắc: Hàm lượng tổng phenolic được xác định dựa vào phương pháp của Francine M.B, et alvà có chỉnh sửa[59]. Các polyphenol trong dịch chiết được xác định bằng đo màu, dùng thuốc thử Folin-Ciocalteu. Thuốc thử này chứa chất oxi hóa là axit phospho-vonframic, trong quá trình khử, các nhóm hydroxy phenol dễ bị oxi hóa, chất oxi hóa này sinh ra màu xanh có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 760 nm. Phản ứng này là do sự hình thành màu xanh của vonfarm và molypden. Các thuốc thử Folin-Ciocalteu phản ứng với nhiều hợp chất polyphenol và mặc dù có thểcó đáp ứng khác nhau với các hợp chất đơn lẻ, thì việc lựa chọn
41 axit gallic (GAE) làm chất chuẩn hiệu chuẩn cũng giúp ích cho việc thu được dữ liệu polyphenol tổng số. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tiến hành:
❖Dựng đường chuẩn axit gallic
+ Pha dung dịch axit gallic theo nồng độ: 5; 100; 200; 500; 1000 µg/ml
+ Thêm 0,2 ml dung dịch axit gallic lần lượt theo các nồng độ cùng với 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu 1:10 vào lọ tối màu
+ Hỗn hợp được đểyên trong 5 phút sau đó đuợc
+ Thêm thêm 0,8ml Na2CO3 7,5% (w/v).
+ Để dung dịch trong bóng tối 75 phút trước khi tiến hành đo.
+ Đo độ hấp thụAbs đo bởi máy đo quang UV-VIS tại 760nm với mẫu trắng được chuẩn bị tương tựnhưng thay mẫu thử bằng metanol
+ Từđó xác định được đường chuẩn
❖Tiến hành xác định:
+ Thêm 0,2ml mật ong đã pha loãng với nồng độ 0,1g/ml cùng với 1ml thuốc thử Folin pha loãng tỷ lệ 1:10 vào lọ tối màu
+ Hỗn hợp được đểyên trong 5 phút sau đó đuợc thêm thêm 0,8ml Na2CO3
7,5% (w/v).
+ Để dung dịch trong bóng tối 75 phút trước khi tiến hành đo
+ Đo độ hấp thụAbs đo bởi máy đo quang UV-VIS tại 760nm với mẫu trắng được chuẩn bị tương tựnhưng thay mẫu thử bằng metanol
+ Đường chuẩn acid gallic (5–1000 µg/ml) được sử dụng làm chất chuẩn tham chiếu.
- Xử lý kết quả:
+ Hàm lượng polyphenol tổng được biểu thị bằng miligram đương lượng acid gallic trên 1 kg mật ong (mg GAE/ kg mật ong) và được tính theo công thức:
𝑇𝑃𝐶 = 𝑎 ∗ 𝑉
10 ∗ 𝑚 (m𝑔
𝐺𝐴𝐸
100𝑔𝑚ậ𝑡 𝑜𝑛𝑔)
Trong đó:
TPC: Hàm lượng Polyphenol tổng (mg GAE/ 100g mật ong)
a: Hàm lượng acid gallic tương đương xác định từđường chuẩn (µg/ml) V: Thể tích mật ong (ml)
42 m: Khối lượng mật ong (g)
2.3.4.3.Xác định hàm lượng tổng flavonoid
- Nguyên tắc: Hàm lượng tổng flavonoid được xác định dựa vào phương pháp của Francine M.B, et al và có chỉnh sửa [59].Dựa vào tính chất tạo phức màu rất mạnh của các flavonoid với kim loại. Ion Al3+thường được sử dụng vì nó tạo phức màu mạnh và không độc hại. Khi cho dịch chiết flavonoid tác dụng với AlCl3, Al3+ sẽ thay thế các H+ở các nhóm -OH liền kề hoặc cách nhau 1C tạo liên kết O- Al-O tạo thành phức có màu. Quercetinđược chọn làm chất chuẩn hiệu chuẩn để thu thập được kết quả flavonoid tổng.
Hình 2.6. Cơ chế phản ứng của flavonoid với AlCl3
- Tiến hành: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
❖Dựng đường chuẩn quercetin
+ Pha dung dịch quercetin theo nồng độ: 0; 50; 100; 150; 200; 250 µg/ml
+ 2ml dung dịch quercetin được trộn với 2ml Al2CO3 2% trong lọ tối màu
+ Để dung dịch trong bóng tối 15 phút trước khi tiến hành đo
+ Đo Abs bằng máy đo UV-VIS tại bước sóng 415nm với mẫu trắng metanol
+ Từđó các định đường chuẩn
❖Tiến hành xác định
+ 2ml dung dịch mật ong 0,3g/ml được trộn với 2ml Al2CO3 2% trong lọ tối màu
+ Để dung dịch trong bóng tối 15 phút trước khi tiến hành đo
+ Đo Abs bằng máy đo UV-VIS tại bước sóng 415nm với mẫu trắng metanol
+ Đường chuẩn quercetin (0–250 µg/ml) được sử dụng làm chất chuẩn tham chiếu
43 Hàm lượng flavonoid tổng được biểu thị bằng miligram đương lượng quercetin trên 100 mật ong (mg QE/ 100g mật ong) và được tính theo công thức:
𝑇𝐹𝐶 = 𝑎 ∗ 𝑉
10 ∗ 𝑚
Trong đó:
TFC: Hàm lượng flavonoid tổng (mg QE/ 100g mật ong)
a: Hàm lượng quercetintương đương xác định từđường chuẩn (µg/ml)