2.3.3.1.Xác định đường kính của vòng tròn kháng khuẩn
- Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp khuếch tán đĩa Kirby-Bauer [58] có chỉnh sửa. Khi mẫu được áp lên đĩa thạch chứa vi khuẩn, các đĩa sẽ hấp thụ một lượng vừa đủnước để hòa mật ong, sau đó khuếch tán vào môi trường. Trong giai đoạn logarit, vi khuẩn trên mặt đĩa thạch nhân lên nhanh hơn so với sự khuếch tán của mật ong. Các tế bào vi khuẩn không bịức chế tiếp tục nhân lên đến khi sự phát triển nhìn thấy bằng mắt thường. Không xuất hiện sựtăng trưởng nếu như mật ong trở thành chất ức chế. Đường kính của vòng tròn kháng khuẩn tỉ lệ thuận với độ nhạy cảm của vi khuẩn [28].
- Tiến hành:
+ Chuẩn bịmôi trường
• Môi trường NB với 8g/1000ml: Pha môi trường với tỉ lệ trên rồi bổ sung thêm agar (15-20g/l), sau đó đem tiệt trùng ở 121±20C trong 1h. Đổ môi trường trong tủ hút với thể tích 15-20 ml môi trường/ đĩa petri
• Nước muối 0,9%: Đem tiệt trùng ở 121±20Ctrong 1h
+ Chuẩn bị vi khuẩn:
• Cho chủng vi khuẩn được cấy từ đĩa thạch vào ống fancol có chứa 5ml NaCl 0,90%
• Đem ống fancol chứa mẫu vi khuẩn trên đi đo Abs với mẫu kiểm chứng là NaCl 0,90% tại bước sóng 600nm
• Pha loãng dịch vi khuẩn đểđạt được nồng độ 106 cfu/ml (với Abs = 0,10 tương đương với nồng độ vi khuẩn là 108 cfu/ml)
+ Xác định
37
• Dùng micropipet hút 100 µl dịch vi khuẩn đã được chuẩn bị cho vào đĩa thạch
• Dùng tăm bông đã được tiệt trùng, chang đều dịch vi khuẩn trên bề mặt thạch của hộp petri
• Dùng đầu côn với đường kính 8mm để tạo ra các giếng trên đĩa thạch
• Nhỏ 100 µl dịch mật ong vài các giếng đã tạo trên
• Đem nuôi cấy ở 370C trong 24h - Xử lý kết quả
+ Sau khi nuôi cấy, trên mặt thạch sẽ xuất hiện các vòng tròng kháng khuẩn (vị trí xung quanh giếng đã nhỏ dịch mẫu và không có vi khuẩn mọc lên)
+ Đo đường kính vòng tròn kháng khuẩn đó. Đường kính của vòng tròn kháng khuẩn tỉ lệ với mức độ kháng khuẩn của mẫu mật ong.
2.3.3.2.Xác định nồng độ kháng khuẩn tối thiểu - MIC
- Nguyên tắc: Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu được xác định bằng phương pháp pha loãng theo Mohd I. Z, et al, có chỉnh sửa[46]. Mẫu mật ong được cho vào các giếng ở các nồng độ khác nhau cùng vi khuẩn và môi trường MHB. Hoạt tính kháng khuẩn trong mật ong sẽức chế sự phát triển tạo khuẩn lạc của vi khuẩn, làm cho dung dịch không bị đục. Sau 24h nuôi cấy, tại nồng độ mật ong nào mà mắt thường nhìn thấy rõ sự ức chế của mẫu đối với vi khuẩn (so với mẫu kiểm chứng) thì tại đó là nồng độ kháng khuẩn của mẫu đối với vi khuẩn đó.
- Tiến hành
+ Chuẩn bị môi trường:
• Môi trường MHB: 21g/1000ml. Pha theo tỉ lệ cần thiết rồi đem tiệt trùng ở 121±2oC trong 1h
• Nước muối 0,9%: Đem tiệt trùng ở 121±2oC trong 1h
+ Chuẩn bị vi khuẩn: Giống với sự chuẩn bị ở phần làm vòng tròn kháng khuẩn
+ Chuẩn bị mẫu
• Đối với một mẫu mật ong, ta pha loãng ởnăm nồng độ khác nhau với môi trường MHB
• Dùng vontex đểđồng nhất mật ong và môi trường MHB
38
• Đĩa 96 giếng được tráng bằng cồn 96o, sau đó để khô (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
• Dùng micropipet lấy 180µl hỗn hợp mẫu mật ong, môi trường và 20µl dịch vi khuẩn cho vào các giếng theo thứ tự
• Mẫu KCm là giếng chỉ chứa 180µl hỗn hợp mẫu mật ong, môi trường
▪ Mẫu KCVK là giếng chứa 180µl môi trường MHB và 20µl dịch vi khuẩn
• Đậy nắp đĩa lại và đem nuôi cấy ở 37oC trong 24h
Hình 2.3. Quy trình tiến hành MIC [16]
- Xử lý kết quả: Tại nồng độ nhỏ nhất nào của mật ong mà mắt thường nhìn thấy rõ sự vẩn đục của giếng - sựức chế của mẫu đối với vi khuẩn (so với mẫu kiểm chứng) thì tại đó là nồng độ kháng khuẩn của mẫu đối với vi khuẩn đó.
2.3.3.3.Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu – MBC
-Nguyên tắc: Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu – MBC thực hiện theo phương pháp của Mohd I.Z,et al, có chỉnh sửa [46].Hỗn hợp dung dịch mật ong, môi trường, vi khuẩn ở giếng MIC được cấy vào đĩa petri. Vi khuẩn ở dịch cấy nào mọc lên thì dịch mật ong tại nồng độ đó không tiêu diệt được vi khuẩn. Nồng độ nhỏ nhất mà tại đó vi khuẩn không mọc lên thì đó là nồng độ diệt khuẩn của mẫu mật ong đối với loại vi khuẩn đang nghiên cứu[28].
- Tiến hành
+ Chuẩn bịmôi trường: Môi trường MHA
• Pha môi trường MHA với tỉ lệ 38g/1000ml
39
• Đổmôi trường trong tủ hút với thể tích 15-20 ml môi trường/ đĩa petri
+ Xác định
• Chia đĩa petri thành 8 phần và đánh số tương ứng với 8 giếng trên 1 cột của đĩa 96 giếng
• Dùng micropipet lấy 10µl dịch từ các giếng và nhỏ giọt tròn lên từng phần đã được đánh sốtương ứng.
• Đem nuôi cấy ở 37oC trong 24h
Hình 2.4. Đĩa petri cấy làm MBC
- Xử lý kết quả: Sau khi nuôi, phần nào không mọc lên khuẩn lạc thì tại nồng độđó đã diệt vi khuẩn. Nồng độ nhỏ nhất diệt được vi khuẩn là nồng độ diệt khuẩn của loại mật ong đó với mẫu vi khuẩn nghiên cứu.