27 QAML1-F 5 'CAC CTA CCA CAG AGC CAT CA AA 3' 28 QAML1-Probe 5' AAC CTC GAA ATC GTA CTG
4.1.2. So sánh kết quả phân nhóm bạch cầu cấp dựa vào dấu ấn miễn dịch tế bào và tủy đồ:
bào và tủy đồ:
Khảo sát tủy đồ và dấu ấn miễn dịch tế bào được thực hiện độc lập, cùng lúc cho kết quả chẩn đoán và phân loại dưới nhóm. Theo phân loại hình thái học, chỉ
ghi nhận có hai nhóm: BCCDL (52,5%) và BCCDT (47,5%). Tủy đồ có hạn chế là không thể phân biệt được dòng B và T như kỹ thuật dấu ấn miễn dịch tế bào. Trong khi dựa vào dấu ấn miễn dịch tế bào, chúng ta có thể phân thành 4 nhóm khác nhau: BCCDT, BCCDL-B, BCCDL-T và BCC biphenotype. Điều này rất cần thiết cho các bác sĩđiều trị trong việc chẩn đoán, chọn lựa phác đồđiều trị và tiên lượng bệnh.
Với bệnh BCCDT, cả hai phương pháp dấu ấn miễn dịch tế bào và tủy đồ đều có khả năng phân loại dưới nhóm từ M0 đến M7 [9], [52]. Tỉ lệ phù hợp giữa hai phương pháp là: 3 trường hợp M0; 3 trường hợp M1; 81 trường hợp M2; 22 trường hợp M3; 14 trường hợp M4; 3 trường hợp M5 và 2 trường hợp M7. Bảng 3.5 đã cho thấy tủy đồ và dấu ấn miễn dịch tế bào có phù hợp chặt chẽ với nhau trong chẩn đoán các phân nhóm từ M0 đến M7, với Kappa = 0,751. Đặc biệt trong
đó, trường hợp phân nhóm M3 được chẩn đoán xác định dựa vào nhiều xét nghiệm khác nhau: tủy đồ, PCR và dấu ấn miễn dịch tế bào. Tiêu chuẩn xác định bằng dấu
ấn miễn dịch tế bào thường căn cứ vào HLA.DR âm tính (HLA.DR-). Tuy nhiên, ngày nay, yếu tố quyết định chính xác BCCDT phân nhóm M3 lại là phức hợp
PML/RARA (dựa vào PCR) [99].
Ở BCCDL, tủy đồ phân BCCDL thành 3 nhóm L1, L2, L3 dựa vào các tiêu chuẩn phân loại về hình thái. Chẩn đoán tủy đồ gồm 2 nhóm chính: L1 (2,2%) và L2 (97,8%); khác với nghiên cứu của tác giả C. H. Pui [112] có tỉ lệ L1 cao nhất. Có sự khác biệt trên có thể do phân loại hình thái học theo FAB thường dựa vào sự
chủ quan của người đọc tủy đồ và do không có một tiêu chuẩn rõ ràng để phân biệt L1 và L2. Song phân biệt L1 và L2 không có ý nghĩa nhiều trong việc tiên lượng cũng như điều trị. Trong nghiên cứu của chúng tôi, không có mối liên quan giữa
hình thái tế bào và các tổ hợp gien (Bảng 3.33), điều này phù hợp các tác giả C. H. Pui [112].
Trong khi đó, kỹ thuật dấu ấn miễn dịch tế bào có thể nhận diện được bản chất tế bào thuộc dòng B hay T, ngoài ra còn xác định được giai đoạn trưởng thành của tế bào. Ở nghiên cứu này, sự phân bố dòng tế bào theo dấu ấn miễn dịch tế bào tập trung ở dòng lympho B (81,6%), bao gồm các thể BCCDL Precursor B, Pro B, common B và B (Bảng 3.9). Tỷ lệ bệnh nhân có dấu ấn miễn dịch tế bào là dòng B chiếm tỷ lệ cao nhất và tỷ lệ này tương tự so với tác giả C. H. Pui [112]. Trong những trường hợp không có sự thống nhất giữa hai kỹ thuật xét nghiệm, chúng tôi cho rằng dấu ấn miễn dịch tế bào có kết luận đáng tin cậy hơn vì phương pháp phân tích khách quan, phản ánh trung thực sự dương tính của các dấu ấn đặc trưng của cùng một dòng, kết hợp với sự âm tính của các dấu ấn thuộc các dòng khác. Ngoài ra, kết quả dấu ấn miễn dịch tế bào ít phụ thuộc vào người đọc khác nhau.
4.2. Các tổ hợp gien lúc mới chẩn đoán
Trong những năm gần đây, nhờ ứng dụng kỹ thuật tế bào dòng chảy xác
định các dấu ấn bề mặt tế bào giúp phân loại dưới nhóm, tuy nhiên BCC vẫn không
đồng nhất về mặt đáp ứng điều trị. Từ năm 1973, nhờ phát triển của phương pháp băng NST và các kỹ thuật di truyền học phân tử như kỹ thuật FISH, PCR, giải trình tự chuỗi DNA… nên các bất thường NST và gien trong BCCDT và BCCDL được phát hiện và nghiên cứu trong mối liên hệ với đáp ứng điều trị. Nhiều nghiên cứu
đa trung tâm trên thế giới như nghiên cứu của MRC-10 (United kingdom Medical research Council), CALGB (Cancer and Leukemia Group B Study), của tác giả
Ching-Hon Pui…đã chứng minh rằng các bất thường NST và gien lúc chẩn đoán là yếu tố tiên lượng độc lập ảnh hưởng đến tỉ lệ lui bệnh và thời gian sống toàn bộ của bệnh nhân bệnh BCC.
Trong BCCDT có 4 chuyển vị NST thường gặp là t(8;21), t(15;17), t(9;11) và inv(16)/t(16 ;16) tạo ra 4 kiểu tổ hợp gien AML1/ETO, PML/RARA, MLL/AF9
VÀ CBFB/MYH11 tương ứng gặp trong 25-30% bệnh nhân. Trong BCCDL cũng có 4 chuyển vị NST thường gặp là t(1;19), t(4;11), t(12;21) và t(9;22) tạo ra 4 kiểu tổ
hợp gien E2A/PBX1, MLL/AF4, TEL/AML1 và BCR/ABL tương ứng gặp trong 30- 35% bệnh nhân.
Các bất thường NST lúc chẩn đoán không tạo ra tổ hợp gien có thể phát hiện bằng NST đồ hoặc FISH, riêng các bất thường NST tạo ra tổ hợp gien trên có thể
phát hiện bằng NST đồ, FISH hoặc PCR. Trong 3 kỹ thuật trên thì PCR là phương pháp phát hiện nhanh, nhạy và giá thành thấp nhất, chỉ cần 1 lượng nhỏ tế bào trong thời gian 24-48 giờ đã có kết quả, trong khi đó NST đồ phải cần tế bào phân chia, còn kỹ thuật FISH thì phải sử dụng 8 loại probe cho 8 chuyển vị NST trên nên giá thành cao.
Vì vậy, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử đặc biệt là kỹ thuật PCR giúp cho việc xác định nhanh các tổ hợp gien trong khoảng 1/3 trường hợp BCC lúc chẩn đoán và sử dụng tổ hợp gien đó như là dấu ấn để theo dõi quá trình
điều trị là vấn đề hết sức quan trọng và cần thiết giúp phân nhóm tiên lượng, lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp và đánh giá đáp ứng điều trị, góp phần nâng cao tỉ lệ
lui bệnh, kéo dài thời gian sống và tiết kiệm chi phí điều trị cho bệnh nhân mắc bệnh BCC tại Việt nam.
Từ ngày 01/10/2009 đến ngày 31/07/2011, 341 bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu cấp đã được chọn vào nhóm nghiên cứu để xác định các bất thường gien, bao gồm nhóm BCCDT (162 BN, chiếm tỉ lệ 47,5%) và nhóm BCCDL (179 BN, chiếm tỉ lệ 52,5%). Các kết quả được trình bày theo nhóm bệnh lý BCCDT và BCCDL như sau:
4.2.1. Nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng tủy
Đối với BCCDT, những bất thường NST lúc chẩn đoán có ý nghĩa tiên lượng rất rõ ràng. Có 4 kiểu chuyển vị NST thường gặp trong BCCDT là
t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q11), inv(16)(p13;q22), và t(9;11)(p21-22;q23) tạo ra 4 kiểu tổ hợp gien là AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 tương
ứng. Trong 4 chuyển vị NST trên, thì t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q11), inv(16)(p13;q22) thuộc nhóm tiên lượng tốt, và t(9;11)(p21-22;q23) thuộc nhóm tiên lượng trung bình.
Từ 01/10/2009 đến 31/07/2011, khảo sát 162 bệnh nhân (BN) BCCDT mới chẩn đoán bằng kỹ thuật RT-PCR, chúng tôi phát hiện 19 BN biểu hiện AML1/ETO
(11,7%), 11 BN biểu hiện PML/RARA (6,8%), 7 BN biểu hiện CBFB/MYH11
(4,3%), và 4 BN biểu hiện MLL/AF9 (2,5%) (Bảng 3.13).
Trong nghiên cứu này, chỉ với kỹ thuật RT-PCR, chúng tôi đã phát hiện
được 41 bệnh nhân có mang 4 kiểu tổ hợp gien thường gặp trên, chiếm tỷ lệ 25,3% giúp phân nhóm tiên lượng được bệnh nhân BCCDT. Trong đó, nhóm tiên lượng tốt (AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11) chiếm tỉ lệ 22,8% (Bảng 3.14), tỉ lệ
này tương đương với nghiên cứu của United Kingdom Medical Research Council (MRC-10). Nhóm còn lại chiếm tỉ lệ 77,2% có biểu hiện MLL/AF9 hay không biểu hiện tổ hợp gien nào trong số 4 tổ hợp gien khảo sát, tuy nhiên chúng ta chưa thể
loại trừ bất thường nhiễm sắc thể (NST) khác nên không xếp vào nhóm tiên lượng trung bình được.
Trong số những chuyển đoạn liên quan đến NST 11q23 thì t(9;11) là một trong những chuyển đoạn chiếm tỉ lệ cao và là chuyển đoạn thường gặp trong bệnh BCCDT, kết quả là tạo thành tổ hợp gien MLL/AF9. Khi khảo sát những bất thường thường gặp trong bệnh BCCDT bằng kỹ thuật RT-PCR, chúng tôi ghi nhận tổ hợp gien MLL/AF9 chiếm tỉ lệ 2,5% (Bảng 3.13). Kết quả này tương đương so với tỉ lệ
khoảng 2,1% so với báo cáo của tác giả Mrozek K và cộng sự [90].
Theo bảng 3.18, chúng tôi nhận thấy trong 4 BN dương tính với tổ hợp gien
MLL/AF9 thì có đến 3 BN (75%) có độ tuổi dưới 15. Ngoài ra, có đến 3 trong số 4 ca (75%) dương tính với tổ hợp gien MLL/AF9 thuộc thể M5. Những kết quả này hoàn toàn phù hợp so với kết quả nghiên cứu của tác giả Swansbury GJ. và cộng sự
cho thấy mặc dù những BN dương tính với tổ hợp gien MLL/AF9 gặp ở mọi lứa tuổi nhưng có hơn 50% BN là dưới 15 tuổi và có 75% BN dương tính với
MLL/AF9 thuộc thể M5 [137].
Ngoài ra, kỹ thuật Multiplex PCR đã giúp phát hiện thêm những tổ hợp gien khác ngoài 4 tổ hợp gien trên như trong bảng 3.15. Trong đó phần lớn những bất thường liên quan đến gien MLL. Do đó, trong tương lai cần khảo sát những đột biến liên quan đến gien này nhằm hỗ trợ cho việc phân nhóm tiên lượng. Đáng chú ý là phát hiện 01 ca BCCDT-M7 có biểu hiện BCR/ABL mà bình thường tổ hợp gien này sẽ không được khảo sát trong nhóm bệnh BCCDT do có tần xuất rất thấp [91]. Theo nhóm nghiên cứu SWOG/ECOG thì BN BCCDT mang tổ hợp gien này được xếp vào nhóm tiên lượng xấu [90]. Tuy nhiên, kỹ thuật Multiplex PCR đòi hỏi tốn nhiều thời gian và công sức khi phải thực hiện qua hai giai đoạn, mỗi giai đoạn hai bước PCR với rất nhiều cặp mồi.
Điều đó cho chúng ta thấy được vai trò quan trọng của NST đồ trong phân nhóm tiên lượng BCCDT, các kỹ thuật di truyền phân tử hiện đại như FISH hoặc RT-PCR cũng chỉ hỗ trợ chứ không thể thay thế hoàn toàn NST đồ. Phân tích NST
đồ có thể nhận diện được tất cả bất thường lớn của NST trên bệnh nhân, nhưng có nhiều điểm hạn chế như phải thu được tế bào phân chia, hoàn thiện được kỹ thuật nhuộm băng, đòi hỏi chuyên viên di truyền được huấn luyện tốt, mất nhiều thời gian
để hoàn thành và bỏ sót những bất thường thểẩn. Ngoài ra, chỉ phân tích tối đa trên 20-50 tế bào phân chia vì thế các kỹ thuật di truyền tế bào phân tử khác liên tục được phát triển để bổ sung cho phân tích NST đồ kinh điển [34].
Năm 1986, kỹ thuật FISH được phát triển bởi Pinkel D. [108]. Kỹ thuật FISH
được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán các bất thường di truyền của ung thư máu vì có lợi điểm là nhạy hơn do phân tích được nhiều tế bào, không cần tế bào phân chia, cho kết quả nhanh, sử dụng 1 hoặc nhiều đoạn dò chuyên biệt nên kết quả đặc hiệu, phát hiện được các tái sắp xếp ẩn và giá thành tuy đắt hơn NST đồ nhưng vẫn còn chấp nhận được so với các kỹ thuật di truyền phân tử khác.
Hiện nay, kỹ thuật FISH và NST đồđược sử dụng thường quy để bổ sung cho nhau trong chẩn đoán các bất thường di truyền tế bào trong các bệnh lý ác tính về máu và cả trong các dạng ung thư khác.Tuy nhiên, kỹ thuật RT-PCR có nhiều ưu điểm trong việc khảo sát bộ 4 tổ hợp gien thường gặp của BCCDT, cụ thể như cho kết quả trong thời gian ngắn nhất (trong vòng 24 giờ), giúp phát hiện các bất thường NST thường gặp. Tiêu biểu như phát hiện t(15;17) và tổ hợp gien PML/RARA đóng góp rất lớn trong việc quyết định điều trị bằng ATRA; cũng như là cơ sở cho chẩn
đoán, theo dõi điều trị và tiên lượng.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, có mối liên quan giữa chẩn đoán tủy đồ và tổ hợp gien (P < 0,0001 - Bảng 3.20), cụ thể liên quan có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) giữa chẩn đoán BCCDT thể M2 và gien AML1/ETO (Bảng 3.21), thể M3 và gien PML/RARA (Bảng 3.22). Nói cách khác, tổ hợp gien PML/RARA thường gặp
ở BCCDT thể M3 và không gặp ở BCCDT thể M2 cũng như các thể khác; trong khi đó tổ hợp gien AML1/ETO thường gặp ở BCCDT thể M2, phù hợp với kết quả
của tác giả Rowe D. và cộng sự [122]. Điều này góp phần cho hướng chẩn đoán chính xác các thể bệnh BCCDT.
Tương tự như vậy, dấu ấn miễn dịch tế bào và tổ hợp gien liên quan có ý nghĩa thống kê (p < 0,0001) (Bảng 3.23). Điều này phù hợp với quần thể nghiên cứu, vì tủy đồ và dấu ấn miễn dịch tế bào phù hợp chặt chẽ với nhau trong chẩn
đoán các phân nhóm từ M0 đến M7, với Kappa = 0,751 (Bảng 3.5).
Mặc dù với số mẫu khảo sát trong từng nhóm bệnh chưa nhiều, nhưng chúng tôi cũng đã xác định được có liên hệ giữa hình thái học, dấu ấn miễn dịch và các
đột biến NST. Cho đến nay, các bất thường về NST liên quan chặt chẽ với bệnh lý ác tính hệ tạo máu và là chỉđịnh rất quan trọng trong việc chẩn đoán và tiên lượng bệnh.
Gần đây, có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng do sự xuất hiện những đột biến gien hoặc những thay đổi về biểu hiện của một gien nào đó đã ảnh hưởng trực tiếp
người lớn lẫn trẻ em [91], [131]. Có mối tương quan giữa kiểu gien được quy định bởi các đột biến trên với dự hậu điều trị hay nguy cơ tái phát ở BN được chẩn đoán BCCDT có kết quả di truyền học bình thường.
Kỹ thuật PCR là một bước tiến quan trọng trong bệnh bạch cầu cấp, là một phương pháp xác định gien nhanh chóng, có độ nhạy cao, ít tốn kém. Trong tương lai, ngoài các kỹ thuật NST đồ, FISH và RT-PCR đã thiết lập điều kiện và ứng dụng thành công vào chẩn đoán các bất thường NST, chúng ta cần triển khai khảo sát các đột biến gien trên để phân nhóm tiên lượng chính xác hơn nữa cho nhóm bệnh nhân có NST đồ bình thường hoặc những bệnh nhân cấy NST không mọc. Trong trường hợp chưa thể phân nhóm tiên lượng thì nên dùng khảo sát tiếp theo bằng kỹ thuật giải trình tự gien và phân tích nhiễm sắc thể.
Kỹ thuật phân tích NST mất nhiều thời gian, tỉ lê thất bại tương đối cao, tuy nhiên, chúng ta cần phối hợp kỹ thuật PCR và phân tích NST đểđánh giá được kiểu hình bất thường gien và NST đầy đủ, góp phần phân nhóm tiên lượng. Kỹ thuật giải trình tự thì phức tạp hơn, kỹ thuật cao, bệnh viện Truyền máu Huyết học đang bước
đầu triển khai, để xác định các đột biến gien FLT3, c-kit, NPM1,… giúp phân nhóm tiên lượng cho nhóm không có tổ hợp gien và bất thường NST. Đồng thời, cũng cần triển khai RQ-PCR đểđịnh lượng số bản sao của những tổ hợp gien để theo dõi đáp
ứng chính xác hơn trong quá trình điều trị. Đó là một công việc lớn cần nhiều thời gian và kinh phí vì liên quan đến nhiều gien và nhiều tổ hợp gien.
Đây là nghiên cứu đầu tiên khảo sát bộ 4 tổ hợp gien AML1/ETO,
PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 trên người Việt Nam. Chúng tôi đã chuẩn hóa thành công và đang sử dụng các kỹ thuật trên một cách thường quy trong khảo sát những bất thường NST và gien cho những bệnh nhân BCCDT tại BV. TMHH TP. HCM.
4.2.2. Nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng lympho
Đối với BCCDL, những bất thường NST lúc chẩn đoán có ý nghĩa tiên lượng rất rõ ràng. Có 4 kiểu chuyển vị NST thường gặp trong BCCDL là t(12;21), t(9;22), t(4;11), t(1;19) tạo ra 4 kiểu tổ hợp gien là TEL/AML1, BCR/ABL,
MLL/AF9 và E2A/PBX1 tương ứng. Trong 4 chuyển vị NST trên, thì t(12;21) thuộc nhóm tiên lượng tốt và 3 kiểu chuyển vị NST còn lại thuộc nhóm tiên lượng không tốt. Bốn kiểu bất thường trên chiếm từ 30% đến 40% trong BCCDL ở trẻ em, vì thế
chúng tôi sử dụng kỹ thuật RT-PCR để khảo sát bộ 4 tổ hợp gien trong tất cả những bệnh nhân mới chẩn đoán.
Từ 01/10/2009 đến 31/07/2011, khảo sát 179 bệnh nhân (BN) BCCDL mới chẩn đoán bằng kỹ thuật RT-PCR, chúng tôi phát hiện 17 BN biểu hiện TEL/AML1
(9,5%), 16 BN biểu hiện BCR/ABL (8,9%), 5 BN biểu hiện MLL/AF4 (2,8%), và 8 BN biểu hiện E2A/PBX1 (4,5%) (Bảng 3.24). Tỉ lệ của 3 tổ hợp gien E2A/PBX1,
MLL/AF4, BCR/ABL tương đương với các nghiên cứu khác; riêng tỉ lệ TEL/AML1