Do độ nhạy rất cao của PCR đồng thời với thao tác rất đơn giản, người ta có khuynh hướng sử dụng phương pháp này để giải quyết nhiều vấn đề. Tuy nhiên, phương pháp này cũng có nhiều mặt hạn chế và đòi hỏi sự thận trọng đặc biệt khi tiến hành thí nghiệm cũng như khi phân tích kết quả. Có thể kể ba vấn đề lớn khi sử
dụng phương pháp PCR:
♦ Kích thước của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên. Trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb. Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dưới 1,5 kb cho kết quả
tốt. Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm.
♦ Sự ngoại nhiễm (contamination) là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao của phương pháp này. Vấn đề đặc biệt cấp thiết trong những ứng dụng về chẩn đoán, dự phòng vì hậu quả có thể rất nghiêm trọng. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước. Người ta đã chứng minh được rằng việc mở nắp các ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại trong một khoảng không gian kín như phòng thí nghiệm sẽ
khiến các phân tử đã được khuếch đại thoát ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí và bám vào tường, cửa, thiết bị, dụng cụ,… rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó. Chúng ta có thể khắc phục một phần vấn đề này bằng một số biện pháp sau:
- Các công đoạn thao tác khác nhau như thiết lập phản ứng PCR và phân tích các sản phẩm khuếch đại, thí dụ nhưđiện di, phải được tiến hành ở
những địa điểm cách xa nhau.
- Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng (micropipette, găng, áo choàng,…) cho các khu vực riêng biệt, không sử dụng vào các thao tác khác. Đặc biệt, các dụng cụ trong khu vực sau PCR không bao giờ được đưa vào khu vực trước PCR.
- Đầu tip sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh sự nhiễm đầu micropipette bởi các phân tử khếch đại khi hút dung dịch phản ứng. - Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại
trước.
- Tất cả mọi thành phần của phản ứng đều được chia thành những lượng nhỏ, tính toán sao cho đủ với 1 hay 2 lần thao tác.
- Sử dụng găng tay, không thao tác trực tiếp bằng tay, tránh lây nhiễm thành phần phân hủy RNA.
♦ Các sai sót gây ra do Taq polymerase cho tỉ lệ sai sót khá cao (10-4, nghĩa là cứ 10.000 nucleotide thì enzym gắn sai 1 nucleotide). Tuy nhiên, đặc tính này
không nghiêm trọng nếu ta chỉ cần xem xét kích thước hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại, nhưng có ý nghĩa lớn nếu cần xác định chính xác trình tự
nucleotide của DNA. Ta không thể loại bỏ hoàn toàn các sai sót mà chỉ có thể giảm bớt; ví dụ như đảm bảo sự cân bằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng, xác
định trình tự của nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh trước khi đi đến trình tự chính thức, đặc biệt là chọn lựa loại Taq Polymerase thích hợp theo mục đích thực nghiệm.