14 PBX1-B 5' TCG CAG GAG ATT CAT CAC G 3'
2.3.8.3. Phản ứng PCR định lượng (RQ-PCR)
Sau khi đã được chuẩn bị, tiến hành chạy RQ-PCR đồng thời mẫu thử, mẫu chuẩn và chứng nội tại ở cùng điều kiện, trên cùng một máy CFX 96 của hãng Biorad. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp RQ-PCR dùng Taqman Probe, với đầu 5’ được đánh dấu bằng FAM, và đầu 3’ được đánh dấu bằng TAMRA.
Thành phần phản ứng RQ-PCR gồm có: 2X TaqMan Universal PCR Master Mix (No AmpErase UNG), mồi xuôi, mồi ngược (Bảng 2.3), Taqman probe (250 nM); 3 µL mẫu (mẫu chuẩn hoặc mẫu chứng nội tại, hoặc mẫu bệnh nhân, và nước
đối với mẫu chứng âm); thêm nước dùng cho PCR để đạt tổng thể tích phản ứng là 20 µL. Nồng độ của mồi cần được khảo sát đểđạt được điều kiện tối ưu cho phản
ứng. Sử dụng máy CFX 96 (Biorad) để thực hiện phản ứng RQ-PCR. Chu trình luân nhiệt cho phản ứng RQ-PCR như sau: 500C trong 2 phút; 950C trong 10 phút; 50 chu kỳ với 950C trong 10 giây, 600C trong 30 giây. Phân tích kết quả trực tiếp trên máy mà không cần qua bước điện di.
Bảng 2.3. Danh sách mồi và probe tương ứng với từng tổ hợp gien STT Tên mồi và probe Trình tự nucleotide Tổ hợp
gien
1 QTEL-F 5' CTC TGT CTC CCC GCC TGA A
3'
2 QTEL-Probe 5' AGA CCC TGA GGC TCA AAG TCA GAT GCT ACT 3' (TAMRA)
3 QAML1-R 5’ CGG CTC GTG CTG GCA T 3’
TEL/AML1
4 QBCR-ABL Major F 5' GAT GCT GAC CAA CTC GTG TG 3' 5 QBCR-ABL Probe 5' AGA CCC TGA GGC TCA AAG
TCA GAT GCT ACT 3' (TAMRA) 6 QBCR-ABL Major
R
5' AAC GAA AAG GTT GGG GTC AT 3'
Major
BCR/ABL
7 QBCR-ABL minor F
5' CTT CCA TGG AGA CGC AGA AG 3'
8 QBCR-ABL Probe 5' AGA CCC TGA GGC TCA AAG TCA GAT GCT ACT 3' (TAMRA) 9 QBCR-ABL minor R 5' AAC GAA AAG GTT GGG GTC AT 3'
minor
BCR/ABL
10 QE2A-F 5' CCA GCC TCA TGC ACA ACC A 3' 11 QE2A-Probe 5' CCC TCC CTG ACC TGT CTC GGC C 3' (TAMRA)