14 PBX1-B 5' TCG CAG GAG ATT CAT CAC G 3'
2.3.8.1. Xây dựng đường chuẩn
Số bản sao của plasmid DNA có mang gien đích cần được tính toán một cách chính xác để sử dụng cho việc dựng đường chuẩn. Khi tiến hành chạy PCR
định lượng song song mẫu chuẩn và mẫu thử, ta có thể xác định tồn lưu tế bào ác tính dựa vào đường chuẩn.
♦ Phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gien/ tổ hợp gien quan tâm (gien đích): Tổng thể tích 1 tuýp phản ứng là 20 µL. Thành phần phản ứng gồm có: Gotaq buffer (loại không màu), MgCl2 (2,5 mM), dNTP (200 µM mỗi loại), mồi xuôi và mồi ngược (0,5 µM mỗi loại), GoTaq Flexi Polymerase (0,5 U), 15 ng cDNA và nước dùng cho PCR. Chu trình luân nhiệt cho phản ứng PCR như sau: 950C trong 2 phút; 45 chu kỳ với 950C trong 30 giây, 580C hoặc 600C (cần được khảo sát để ghi nhận điều kiện tối ưu cho từng cặp mồi đối với từng gien/ tổ hợp gien) trong 30 giây, 720C trong 30 giây; và cuối cùng 720C trong 5 phút. Điện di
đọc kết quả trên thạch 2%.
♦ Phản ứng nối gien đích vào vector: gien đích vừa được khuếch đại phải
được gắn vào vector trong vòng 60 phút sau phản ứng PCR. Thành phần phản ứng như sau: 3 µL sản phẩm PCR của đoạn gien đích, 1 µL pGEM-T Easy vector (50 ng), 5 µL 2X Rapid ligation buffer, 1 µL T4 DNA Ligase tạo thành hỗn hợp có tổng thể tích 10 µL. Ủở nhiệt độ phòng trong 60 phút hoặc 40C qua đêm trước khi chuyển vector mang gien đích vào E. coli.
♦ Chuyển đoạn gien quan tâm vào tế bào ký chủ: Cho 2 µL hỗn hợp chứa vector mang gien đích và 50 µL tế bào ký chủ JM109 vào tuýp 2,0 mL. Chuyển tuýp chứa huyền phù tế bào vào hộp giữ lạnh trong 20 phút. Gây sốc nhiệt ở 420C trong 45 giây (không lắc), sau đó đặt tuýp trở lại hộp giữ lạnh trong 2 phút. Thêm
950 µL môi trường LB Broth vào, và lắc dung dịch huyền phù tế bào ở 370C trong 1 giờ. Sau đó, trải 100 – 300 µL dung dịch huyền phù tế bào ký chủ lên đĩa môi trường thạch LB có kháng sinh Ampicillin và được bổ sung IPTG/X-Gal để hỗ trợ
cho việc lựa chọn tế bào có mang vector chứa gien đích. Ủ qua đêm (16 - 18 giờ) ở
370C. Chọn 6 khuẩn lạc trắng để kiểm chèn bằng PCR.
♦ PCR kiểm chèn: Dùng đầu tăm nhọn thu nhận khuẩn lạc trắng cho vào 30 µL môi trường LB Broth. Lấy 1 µL huyền phù tế bào trộn với 0,1 µL (0,5 U) GoTaq Polymerase (Promega), 1 µL (10 pmol) mồi SP6-pGEM (5’-ATT TAG GTG ACA CTA TAG AA-3’) và 1 µL (10 pmol) mồi T7-pGEM (5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’) trong 15 µL hỗn hợp để thực hiện phản ứng PCR kiểm chèn. Chu trình luân nhiệt cho phản ứng PCR như sau: 950C trong 2 phút; 35 chu kỳ với 950C trong 30 giây, 550C trong 30 giây, 720C trong 1 phút; và cuối cùng 720C trong 5 phút. Điện di đọc kết quả, chọn dòng tế bào chứa vector có mang
đoạn gien đích. Nếu vẫn chưa thu nhận được dòng tế bào có mang gien đích thì lặp lại bằng việc chọn những khuẩn lạc trắng khác và tiếp tục thực hiện PCR kiểm chèn.
♦ Nhân dòng tế bào có mang gien đích: Lấy 5 µL dòng tế bào chứa vector mang gien đích cho vào 3 mL môi trường LB Broth có chứa 3 µL Ampicillin lắc 150 đến 200 vòng/ phút ở 370C qua đêm.
♦ Ly trích plasmid DNA: Tiến hành ly trích plasmid DNA từ dịch huyền phù tế bào vi khuẩn bằng QIAGEN Plasmid Mini kit của hãng QIAGEN (theo qui trình công ty). Xác định nồng độ plasmid DNA bằng máy đo quang phổ Ultrospec 5300 pro. Chọn mẫu có OD260:OD280 = 1,8 – 2,0.
♦ Pha loãng mẫu để dựng đường chuẩn: Tính số bản sao plasmid DNA. Xác
định thể tích plasmid DNA cần lấy đểđạt nồng độ 1 x 109 copies/3 µL. Pha loãng bậc 10 liên tiếp, chọn 5 ống nghiệm tương ứng với 5 độ pha loãng 102 copies/ 3 µL, 103 copies/ 3 µL, 104 copies/ 3 µL, 105 copies/ 3 µL, 106 copies/ 3 µL.