3. ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.2 Phương pháp pha loãng, ñế m số xác ñị nh số lượng vi khuẩn
Phương pháp này dùng ñể xác ñịnh ñậm ñộ vi khuẩn của canh trùng nuôi cấy trong quá trình sản xuất: kết thúc giai ñoạn nuôi cấy trong môi trường tăng sinh, kết thúc giai ñoạn nhân giống trong nồi lên men 10 lít và 100 lít.
Xếp 1 dãy ống nghiệm vào giá ống nghiệm. Dùng bút cồn ñánh số thứ tự
từ 1 - n (n: số thứ tự của ống nghiệm cuối cùng, 10-n: nồng ñộ pha loãng nhỏ
nhất ñể ñếm số). Dùng pipet loại 10ml hút 4,5ml nước sinh lý 9‰ vào từng
ống nghiệm trên.
Tiếp tục dùng pipet loại 1ml hút 0,5ml canh trùng nuôi cấy cho vào ống nghiệm thứ nhất, trộn ñều, dùng pipet thứ 2 hút 0,5ml canh khuẩn từ ống nghiệm 1 sang ống nghiệm 2, trộn ñều. Hút 0,5ml canh trùng từ ống thứ 2
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………36
sang ống nghiệm thứ 3 và cứ làm như thế cho ñến ống nghiệm cuối cùng. Ta
ñược dãy ống nghiệm có ñộ pha loãng canh khuẩn theo thứ tự 10-1, 10-2…10- (n-1), 10-n
Hút 0,1ml canh khuẩn ở ống nghiệm thứ n, láng ñều trên môi trường thạch ñĩa (mỗi ñộ pha loãng cấy vào 5 ñĩa). ðem toàn bộ các ñĩa thạch ñã
ñược cấy canh khuẩn bồi dưỡng ở 37oC trong 24 giờ. Sau ñó, lấy ra ñếm số
lượng khuẩn lạc mọc trên bề mặt thạch. ðếm tổng số khuẩn lạc trên 5 ñĩa thạch rồi lấy số trung bình. Nhân số trung bình với 10 ñể tìm số lượng vi khuẩn có trong 1 ml canh trùng ở ñộ pha loãng thứ n dùng trong thí nghiệm và cuối cùng nhân với hệ số pha loãng (10n), tính ra số lượng vi khuẩn trong 1 ml canh trùng ban ñầu cần xác ñịnh.
Công thức tính như sau:
Trong ñó: A là số vi khuẩn trung bình trong 1 ml canh trùng ở ñộ pha loãng thứ n
N là hệ số pha loãng của canh trùng
Trường hợp ñếm số vi khuẩn trong lọ vacxin ñông khô: Cũng dùng dãy
ống nghiệm như trên, ống 1 chứa 10ml nước sinh lý. Dùng nước trong ống
0,5ml C.khuẩn 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 1 2 3 n-1 n 4,5ml 4,5ml 4,5ml 4,5ml 4,5ml Thể tích nước sinh lý 10-1 10-2 10-3 10-(n-1) 10-n ðộ pha loãng: Số vi khuẩn trong 1 ml canh trùng = A x N
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………37
này hoà tan ống vacxin ñông khô, tráng ñi tráng lại nhiều lần, ñảm bảo lấy
ñược hết vi trùng trong ống ñông khô vào ống nghiệm 1. Sau ñó các bước tiến hành như trên.