- Ria cấy: kiểm tra dung quang của khuẩn lạc THT
4.2.2 Kết quả kiểm tra giống sau khi nhân giống lần 1 (trong nồi lên men Fermentor 10 lít)
Fermentor 10 lít)
Lên men sục khí là một công nghệ sản xuất mới, ñặc biệt hiệu quả ñối với sản xuất vacxin. Hiện nay công nghệ này ñược áp dụng phổ biến trên thế
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………47
tiến bộ khoa học như công nghệ chế tạo máy, ñiện tử tin học, công nghệ vi sinh vật… với mục ñích cung cấp ñầy ñủ các ñiều kiện tối ưu như vòng khuấy, oxy, nhiệt ñộ… cho vi sinh vật phát triển.
Trong quá trình sản xuất vacxin tụ huyết trùng trâu bò, công nghệ lên men sục khí sẽ giúp tối ưu hoá các chỉ tiêu phục vụ nuôi cấy vi khuẩn như
oxy, pH, nhiệt ñộ… Vì thế, vi khuẩn luôn có ñiều kiện tốt nhất ñể tiếp xúc với dưỡng chất, dưỡng khí trong ñiều kiện pH thuận lợi. Từñó làm tăng mật ñộ vi khuẩn, giảm thời gian nuôi cấy.
ðối với phương pháp nuôi cấy truyền thống (nuôi cấy tĩnh), phải sử dụng
ñến một phòng ấm lớn, duy trì nhiệt ñộở 370C. Nồng ñộ không khí trong bình nuôi cấy có giới hạn, không có thông tin về sự biến ñổi pH trong môi trường, cũng không có máy khuấy mà nhân viên kỹ thuật phải ñịnh kỳ lắc các bình canh trùng. Thời gian tiến hành nuôi cấy sản xuất cũng dài hơn so với nuôi cấy bằng phương pháp lên men sục khí.
Như vậy, có thể thấy ñược tính ưu việt của phương pháp nuôi cấy lên men sục khí mang lại nhiều lợi ích hơn so với phương pháp nuôi cấy tĩnh.
4.2.2.1 Kết quả kiểm tra thuần khiết
Các kết quả ở giai ñoạn kiểm tra chất lượng giống và ñếm số giống vi khuẩn trong môi trường tăng sinh chúng tôi nhận thấy cả 5 lô giống sản xuất vacxin tụ huyết trùng trâu bò ñều ñạt các tiêu chuẩn vi sinh vật ñó là: ñặc
ñiểm hình thái, tính chất bắt màu, khuẩn lạc ñặc trưng phù hợp với ñặc tính sinh vật của vi khuẩn P.multocida. Kiểm tra thuần khiết ñạt theo tiêu chuẩn ngành 10 TCN 161 - 92 và số lượng vi khuẩn lớn hơn 1 tỷ VK/ml canh trùng. Các lô giống này ñược tiếp tục ñưa vào cấy trong nồi lên men Fermentor, dung tích 10 lít (nhân giống lần 1). Môi trường nuôi cấy giống trong nồi lên men vẫn tương tự như nhân giống trong môi trường tăng sinh, tuy nhiên ởñây phương pháp nuôi cấy lên men sục khí có sự khác biệt so với phương pháp nuôi cấy tĩnh.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………48
Quá trình nuôi cấy trong nồi lên men 10 lít chính là bước ñệm cho công tác nhân giống vacxin. Giai ñoạn lên men này nhằm mục ñích gia tăng nhanh chóng mật ñộ vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy, ñể rút ngắn quá trình nuôi cấy sản xuất khi nhân giống lần 2 trong nồi lên men 100 lít.
Tiến hành tập trung giống từ các lọ tam giác nuôi cấy tăng sinh vào một bình chứa (lượng canh trùng giống khoảng 2 lít) rồi chuyển sang nồi lên men. Lúc này trong nồi lên men ñã có sẵn môi trường nuôi cấy vô trùng. ðiều chỉnh và duy trì nhiệt ñộ trong nồi lên men 370C trong suốt quá trình nuôi cấy. Khuấy và sục khí liên tục. Các thông tin bình thường hay bất bình thường như nhiệt ñộ, oxy, sự thay ñổi pH… trong nồi lên men ñều ñược hiển thị qua màn hình và ñược lưu giữ trong máy tính.
Sau khoảng 3 giờ, kết thúc quá trình nuôi cấy thì lấy mẫu trong nồi ñể ñếm số, kiểm tra lại ñộ thuần khiết của giống. ðây là một trong những chỉ tiêu kiểm tra vi sinh vật thường quy trong quá trình sản xuất vacxin. Kết quả kiểm tra thuần khiết ñược trình bày ở bảng 4.4.
Bảng 4.4: Kết quả kiểm tra thuần khiết giống sau khi nhân giống lần 1
(trong nồi lên men 10lít)
Môi trường nuôi cấy/kết quả thuần khiết Lô vacxin Thạch máu Thạch thường Nước thịt ống Nước thịt gan yếm khí Thạch nấm TB 1 TK TK TK TK TK TB 2 TK TK TK TK TK TB 3 TK TK TK TK TK TB 4 TK TK TK TK TK TB 5 TK TK TK TK TK
Ghi chú: TK = thuần khiết
Từ số liệu kiểm tra trong bảng 4.4 cho thấy, cả 5 lô sản xuất ñều cho kết quả thuần khiết ở cả 5 loại môi trường nuôi cấy cơ bản: thạch máu, thạch thường, nước thịt ống, nước thịt gan yếm khí và thạch nấm.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………49
4.2.2.2 Kết quả kiểm tra số lượng vi khuẩn giống sau khi nhân giống lần 1
Số lượng vi khuẩn sau khi nuôi cấy quyết ñịnh ñến lượng kháng nguyên có trong vacxin sau này, vì thế việc xác ñịnh số lượng vi khuẩn là chỉ tiêu kiểm tra cần thiết và bắt buộc.
Tiến hành lấy mẫu trong nồi Fermentor 10 lít, kiểm tra số lượng vi khuẩn (phương pháp tương tự như mục 4.2.1.2). Nuôi dưỡng trong ñiều kiện 370C, 24 giờ ñem ra ñếm số lượng khuẩn lạc trên ñĩa thạch máu. Kết quả ñếm số ñược trình bày ở bảng 4.5.
Bảng 4.5: Kết quảñếm số lượng vi khuẩn giống sau khi nhân giống lần 1
Lô vacxin ðĩa 1 ðĩa 2 ðĩa 3 ðĩa 4 ðĩa 5 T.Bình Số lượng VK(tỷ/ml) TB 1 112 113 109 110 112 111,2 11,12 TB 2 103 105 104 100 104 103,2 10,32 TB 3 105 103 107 106 106 105,4 10,54 TB 4 107 109 108 110 111 109,0 10,90 TB 5 102 106 103 105 106 104,4 10,44
Theo tiêu chuẩn sản xuất vacxin tụ huyết trùng trâu bò thì số lượng vi khuẩn trong giai ñoạn này từ 9 - 10 tỷ VK/ml canh trùng nuôi cấy là ñạt yêu cầu. Do vậy, số lượng vi khuẩn ñược tổng hợp trong bảng 4.5 khẳng ñịnh, cả
5 lô ñều ở trên mức cho phép và số lượng vi khuẩn cao nhất ở lô 1, ñạt 11,12 tỷ vi khuẩn/1ml canh trùng. Thấp nhất ở lô thứ 2, 10,32 tỷ trong 1ml canh trùng nuôi cấy.
Như vậy, ở giai ñoạn nhân giống lần thứ nhất (trong nồi lên men 10 lít), các chỉ tiêu thuần khiết và ñếm số phù hợp với chỉ tiêu ñề ra của quy trình sản xuất ñối với vacxin tụ huyết trùng trâu bò sản xuất bằng công nghệ lên men sục khí.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………50
4.2.3 Kết quả kiểm tra thuần khiết và số lượng vi khuẩn sau khi nhân giống lần 2 (trong nồi lên men Fermentor 100 lít)