- Pha mụi trường lỏng
g) Thử nghiệm nhận dạng trung hũa vi lượng týp
* Pha loóng mẫu:
- Nồng ủộ pha loóng mẫu cuối cựng 100 TCID50 / 0,1 ml, căn cứ vào kết quả
hiệu giỏ của cỏc mẫu vắc xin ủơn týp sau lọc khụng cú MgCl2 ủể tớnh tỷ lệ pha loóng và quyết ủịnh nồng ủộ pha loóng.
- Thể tớch mẫu ở nồng ủộ 100 TCID50/ 0,1 ml: 0,05ml ì 7 giếng / mẫu = 0,35ml, thể tớch mẫu pha loóng 1,0 ml.
- Xỏc ủịnh thể tớch mẫu ủặc cần thiết ủể pha loóng và cỏch pha loóng như
sau :
Vmẫu ủặc = V : (10a : 102)
Trong ủú : V là thể tớch mẫu pha loóng cần pha 10a nồng ủộ của mẫu (hiệu giỏ)
102 nồng ủộ cuối cựng của mẫu cần pha
- Nếu pha trực tiếp: 0,00001 ml mẫu + 0,9999 ml MEM 2%FBS thỡ lượng mẫu quỏ nhỏ sẽ khụng chớnh xỏc, khi ủú pha loóng giỏn tiếp hỡnh thức pha loóng sẽ ủược quy ủổi như sau: 0,00001 ml = 0,1 ml ì 1/104, như vậy, pha loóng 4 lần bậc 10, sơủồ pha loóng sẽ như sau :
10-1 10-2 10-3 10-4
Mẫu 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml
MEM 2% FBS 0,9 ml 0,9 ml 0,9 ml 0,9 ml
* Pha loóng khỏng huyết thanh ủặc hiệu 3 týp I, II, III
- Nồng ủộ sử dụng 0,5UI / 0,1 ml
- Tớnh lượng khỏng huyết thanh cần dựng
V (KHT týp I) = (số mẫuì0,1 ml)+0,15ml (ủối với giếng KHT ủối chứng) V (KHT týp II) = (số mẫuì0,1 ml)+0,15ml (ủối với giếng KHT ủối chứng) V (KHT týp III) = (số mẫuì0,1 ml)+0,15ml (ủối với giếng KHT ủối chứng)
- Pha loóng từ KHT ủặc nồng ủộ 20UI / 0,1ml, pha loóng bằng MEM 2% FBS
* Nhỏ khỏng huyết thanh
- Nhỏ 0,05 ml KHT týp I / giếng : A1 - A12 ; B1 - B12 và H1 - H3 - Nhỏ 0,05 ml KHT týp II / giếng : C1 - C12 ; D1 - D12 và H4 - H6 - Nhỏ 0,05 ml KHT týp III / giếng : E1 - E12 ; F1 - F12 và H7 - H9 - Sử dụng pipet man 8 kờnh ủể nhỏ khỏng huyết thanh.
* Nhỏ mẫu vắc xin chuẩn và mẫu
- Nhỏ 0,05 ml mẫu (mẫu chuẩn) / 1 giếng ì 14 giếng
- Nhỏ theo chiều dọc của phiến : cột 1, 2 từ hàng A - hàng G (mẫu R1) ; cột 2, 3 hàng A - hàng G (mẫu tiếp theo)... cho ủến hết * Thờm mụi trường - Thờm 0,05 ml MEM 2% FBS và tất cả cỏc giếng hàng G (cỏc giếng ủối chứng mẫu), và cỏc giếng H1 - H9 (cỏc giếng ủối chứng khỏng huyết thanh) - Nhỏ 0,1 ml MEM 2% FBS cho cỏc giếng H10 - H12 (cỏc giếng ủối chứng tế bào)
* Trung hoà ở 370C / 3 giờ * Nhỏ tế bào:
- Tế bào Hep2C ủược tỏch thành hỗn dịch tế bào - Pha hỗn dịch về nồng ủộ 105 tế bào / 1 ml. - Pha hỗn dịch tế bào bằng MEM 2% FBS
- Nhỏ 100 àl hỗn dịch tế bào/ giếng và nhỏ vào tất cả cỏc giếng. - Dựng pipet man 8 kờnh và ủầu Týp nhựa 200 àl ủể nhỏ tế bào. - Dỏn kớn phiến bằng băng dớnh.
- Thao tỏc ủược tiến hành trong Hood vụ trựng.
* Nuụi ở 360C / 7 ngày * ðọc kết quả:
- Giếng cú hiện tượng tế bào co trũn cú sự huỷ hoại: (+)
* Nhận ủịnh kết quả:
- Mẫu vắc xin là týp I khi: cỏc giếng hàng A và B khụng cú sự huỷ hoại tế
bào, tế bào vẫn phỏt triển bỡnh thường
- Mẫu vắc xin là týp II khi: cỏc giếng hàng C và D khụng cú sự huỷ hoại tế
bào, tế bào vẫn phỏt triển bỡnh thường
- Mẫu vắc xin là týp III khi: cỏc giếng hàng E và F khụng cú sự huỷ hoại tế
bào, tế bào vẫn phỏt triển bỡnh thường