NGHIấN CỨU
3.1. ðỐI TƯỢNG NGHIấN CỨU
ðể thực hiện ủề tài: “Nghiờn cứu sản xuất khỏng thể bại liệt trờn thỏ và ủỏnh giỏ tớnh an toàn của văcxin bại liệt trong phũng thớ nghiệm”, chỳng tụi tiến hành nghiờn cứu trờn cỏc ủối tượng là:
Virus bại liệt chuẩn ủể sản xuất Văcxin do Viện Kitasato Nhật Bản cung cấp. Văcxin bại liệt ủơn týp và văcxin bại liệt tam liờn (cú cả 3 týp I, II, III).
ðộng vật thớ nghiệm (Khỉ tỏch tế bào, thỏ và chuột tiờm thử nghiệm,…). Tế bào, mụi trường và dụng cụ nuụi tế bào.
3.2. ðỊA ðIỂM
Phũng Kiểm ủịnh TTNCSX văcxin và Sinh phẩm Y tế (135 Lũ ủỳc và 418 Vĩnh Hưng- Hà Nội).
Trại chăn nuụi khỉðảo Rều - Quảng Ninh.
3.3. NỘI DUNG NGHIấN CỨU
3.3.1. Nghiờn cứu sản xuất khỏng thể bại liệt trờn thỏ
3.3.1.1.Sản xuất khỏng nguyờn bại liệt. 3.3.1.2. Tạo khỏng thể bại liệt trờn thỏ.
3.3.1.3. Thu, xử lý và bảo quản huyết thanh thỏ.
3.3.2. Xỏc ủịnh tớnh an toàn của văcxin bại liệt trong phũng thớ nghiệm
3.3.2.1. Kiểm tra nguyờn liệu ủầu (khỉ) dựng cho sản xuất tế bào. 3.3.2.2. Kiểm tra tế bào dựng trong sản xuất văcxin
3.3.2.3. Kiểm tra an toàn văcxin bỏn thành phẩm
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
Hiện nay, chỳng tụi nghiờn cứu sản xuất khỏng thể bại liệt trờn thỏ, dựa theo quy trỡnh sản xuất văcxin bại liệt sống uống tại Trung tõm nghiờn cứu sản xuất văcxin và Sinh phẩm y tế. Quy trỡnh ủang nghiờn cứu và thực hiện cú tham khảo tài liệu của nước ngoài.
3.4.1. Sản xuất khỏng thể bại liệt
3.4.1.1. Phương phỏp sản xuất khỏng nguyờn bại liệt
Chủng giống tế bào ủược Viện nghiờn cứu bại liệt Nhật Bản cung cấp, nuụi cấy trờn tế bào thận khỉ sạch (chưa sử dụng cho cỏc thử nghiệm nào, khụng nhiễm cỏc loại virus do WHO ủề ra)
a) Nuụi cấy tế bào thận khỉ tiờn phỏt trờn chai roux 225 cm2 * Nuụi tế bào trờn chai 225 cm2
- Ly tõm hỗn dịch tế bào ở 1500 vũng/ phỳt trong 5 phỳt, chắt bỏ nước nổi.
- Lấy 30ml mụi trường ủó pha ở trờn cho từ từ vào tuýp ủểủỏnh tan tế bào.
- Hỳt toàn bộ lượng hỗn dịch tế bào ủó ủỏnh tan vào chai mụi trường ủó pha, trộn ủều và chia vào chai 225 cm2, mỗi chai 120ml.
- ðậy chặt nỳt lắc ủều .
- Nuụi ở nhiệt ủộ 370C.
b) Tinh sạch khỏng nguyờn và pha khỏng nguyờn - Hộn cỏc loạt khỏng nguyờn ủó sản xuất. - Ly tõm 4.000 vũng/40 phỳt ở 40C. - Lọc qua : 0,2 àm/0,45àm/0,8 àm. - Siờu lọc. - Siờu ly tõm 36.000 vũng/4 giờ/60C. - Siờu ly tõm 15.000 vũng 30 phỳt/60C.
- Lọc qua 0,2 àm → cho vào ampul bảo quản ở - 800C - Pha khỏng nguyờn 106CCID/0,1ml
3.4.1.2. Tạo khỏng thể bại liệt trờn thỏ
a) Chọn lọc thỏ
Chọn những thỏ khoẻ mạnh, chưa sử dụng cho cỏc thử nghiệm nào. Trọng lượng thỏ phải ủạt từ 1,8 kg ủến 2,2 kg. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thỏ ủược nuụi cỏch ly và theo dừi trong vũng 1 tuần về tỡnh trạng sức khoẻ, vận ủộng, trọng lượng,…. Sau ủú mới chọn thỏ cú tăng trọng bỡnh thường (Tăng cõn ủều, khụng nhanh quỏ hoặc quỏ chậm) ủể tiờm gõy ủỏp ứng miễn dịch.
Hỡnh 6. Chọn thỏ Hỡnh 7. Nuụi nhốt cỏch ly mỗi con một lồng
b) Phương phỏp tiờm thỏ
Cú 2 phương phỏp tiờm thỏ bao gồm: Phương phỏp tiờm dưới da và tiờm bắp
ủựi.
* Phương phỏp tiờm dưới da:
- Thỏủủ tiờu chuẩn cho sử dụng tiờm khỏng nguyờn gõy ủỏp ứng miễn dịch cần tiờm trong da thỏ với cỏc liều lượng tuỳ chọn.
- Quy trỡnh tiờm thỏ kộo dài trong 4 tuần gồm 3 mũi tiờm theo sơủồ dưới
ủõy:
Nhập thỏ Gõy nhiễm (M1) Gõy nhiễm (M2) Gõy nhiễm (M3) Lấy mỏu kiểm tra khỏng thể bại liệt trước khi tiờm sau thời gian nuụi cỏch ly 1 tuần
+ Tiờm mũi 1: vào ngày thứ 1 sau 1 tuần nuụi cỏch ly.
Tiờm trong da 0,5 ml khỏng nguyờn + 0,5 ml tỏ dược toàn phần (FCA/thỏ)
Hỡnh 8. Thỏ trước khi tiờm Hỡnh 9. Thỏ khi tiờm
+ Tiờm mũi 2: vào ngày thứ 14
Sau tiờm mũi 1 là 14 ngày, tiờm trong da 0,5 ml KN + 0,5 ml tỏ dược khụng toàn phần (FIA/thỏ)
Hỡnh 10. Thỏ sau khi tiờm Hỡnh 11. Vết sẹo tiờm trong da Thỏ sau 2 tuần
+ Tiờm mũi 3: vào ngày thứ 21
Sau tiờm mũi 2 là 7 ngày, tiờm trong da 0,5 ml KN + 0,5 ml tỏ dược khụng toàn phần (FIA/thỏ)
* Phương phỏp tiờm bắp ủựi:
Phương phỏp này về cơ bản giống phương phỏp trờn, song, vị trớ tiờm dưới bắp ủựi và tỷ lệ liều lượng tiờm là 2,5 ml khỏng nguyờn + 2,5 ml tỏ dược.