Lấy mỏu, sau ủú chắt huyết thanh ủể kiểm tra ủỏp ứng miễn dịch:
Mo M1 M2 M3 M4 M5
Lấy mỏu từ mũi 1 ủến mũi 4 lần lượt theo cỏc ngày thứ :
1 → 21 → 28 → 38 → 55 → 66 ngày sau khi tiờm khỏng nguyờn.
Hỡnh 12. Chuẩn bị lấy mỏu Hỡnh 13. Vị trớ lấy mỏu
ðến ngày thứ 66 (sau tiờm mũi 3 là 38 ngày), lấy toàn bộ mỏu thỏ vào chai dẹt ủểở nhiệt ủộ phũng 4 tiếng. Chắt huyết thanh lần 1 bảo quản 40C qua ủờm, sau
ủú, chắt toàn bộ huyết thanh rồi ly tõm 3000rpm/20 phỳt. Bảo quản bằng cỏch cho vào týp nhựa 50 ml ở ( -300C).
Hỡnh 14. Lấy mỏu từ mũi 0 ủến mũi 4 Hỡnh 15. Lấy mỏu toàn bộ (mũi 5)
e) Xử lý huyết thanh thỏ và bảo quản huyết thanh bại liệt
- Ly tõm huyết thanh 3000 vũng/ 7 phỳt. Chắt phần huyết thanh phớa trờn. - Chứa huyết thanh trong týp nhựa 50 ml. Bảo quản huyết thanh vào tủ lạnh –
200C
f) Xỏc ủịnh hiệu giỏ khỏng thể bại liệt Cỏc bước tiến hành
Chuẩn bị mẫu
Mỗi mẫu pha loóng 8 nồng ủộ : từ 10-1 → 10-2 cần 8 lọ pha loóng mẫu / 1 mẫu.
Tiến hành pha loóng bậc 10, quỏ trỡnh pha loóng theo sơủồ sau :
10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7 10 -8
Mẫu 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 ml
MT 1,8 1,8 1,8 1,8 1,8 1,8 1,8 1,8 ml
- MT : mụi trường duy trỡ 2% BS (MEM 2% Bovin serum)
- Nhỏ mẫu ủó pha loóng vào phiến 96 giếng. Nhỏ 100 àl/ giếng, mỗi nồng
ủộ nhỏ 8 giếng (theo chiều dọc từ hàng A → hàng H theo sơủồ phiến). - Mỗi mẫu nhỏ 4 nồng ủộ từ 10 -5
→ 10 -8
Nhỏ tế bào
- Tế bào HEP2C ủược tỏch thành hỗn dịch tế bào - Pha hỗn dịch về nồng ủộ 105 tế bào / 1 ml.
- Pha hỗn dịch tế bào bằng MEM 2% Bovin serum.
- Dỏn kớn phiến bằng băng dớnh.
- Thao tỏc ủược tiến hành trong Hood vụ trựng. - Nuụi ở 360C / 7 ngày.
ðọc kết quả
- Soi kớnh hiển vi tỡm ủỏm huỷ hoại tế bào do virut vắc xin Bại liệt (CPE)
- Giếng cú hiện tượng tế bào co trũn cú sự huỷ hoại: (+)
Tớnh hiệu giỏ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quảủược tớnh theo cụng thức Karber:
+ − = 0,5 log 50 N S D L CCID Trong ủú:
- L là log của nồng ủộ pha loóng cao nhất cú 100% cú số giếng huỷ hoại. - D là sự chờnh lệch log giữa cỏc nồng ủộ pha loóng mẫu, ởủõy do pha
loóng bậc 10 nờn D = 1.
- S là tổng số giếng huỷ hoại ở nồng ủộ pha loóng trong ủú khụng cú 100% số giếng huỷ hoại.
- N là số giếng gõy nhiễm cho mỗi nồng ủộ pha loóng. Nhận ủịnh kết quả
- Mỗi mẫu phải làm lặp lại 3 lần và tớnh hiệu giỏ trung bỡnh. - Hiệu giỏ giữa cỏc lần thực hiện cho phộp dao ủộng 0,5 log10.
- Mẫu KHT ủơn týp ủược chấp nhận khi hiệu giỏ pha loóng nhất cú sự
trung hoà giữa KN và KT
3.4.2. Xỏc ủịnh tớnh an toàn của vắc xin bại liệt trong phũng thớ nghiệm
3.4.2.1. Phương phỏp kiểm tra nguyờn liệu ủầu vào – Khỉ dựng cho sản xuất tế
bào