- Các chất điều khiển sinh trưởng.
c)Những phương pháp chuyển gene.
DNA có thể đưa vào tế bào hoặc cùng lắng tủa với calci phosphate hay liên kết với DEAE-dextran. Vào nhân, DNA được gài vào một cách ngẫu nhiên trong một hay nhiều chromosome của tế bào chủ. Dòng tế bào bền chứa DNA được sát nhập thì biểu hiện những tín hiệu chứng tỏ có sự sát nhập. Quan trọng hơn cả là sự chuyển gene dòng vector retrovirus.
Những virus RNA đó sát nhập vào vào trong nhiễm sắc thể của tế bào với những bản sao DNA của chúng. Tất cả những đoạn mã hoá protein của bộ gene virus có thể bị mất và gene được chuyển tới được đặt giữa đôi của những đoạn trình tự nhắc lại ở những đầu cuối của virus (LTRs-long terminal repeat). Nếu như DNA virus tái tổ hợp được bao gói bới “herpes virus” (virus này cung cấp đoạn mã hoá protein cần thiết để dịch mã), thì đoạn tái tổ hợp này có thể gây nhiễm 100% các tế bào nhân. Hơn nữa vì cơ chế sát nhập bao gồm sự tái tổ hợp đặc hiệu ở LTRs nên DNA chiếm chổ giữa chúng luôn luôn sát nhập nguyên vẹn vào bộ gene.
Muốn tối ưu hoá sự biểu hiện của gene chuyển người ta cho rằng nên ghép thêm một đoạn biểu hiện promotor mạnh và thường cài đặt một hay nhiều chổ trong gene của virus.
Dựa vào phương pháp này, vector của adenovirus đã được dùng để biểu hiện nhiều gene có hiệu quả trong đó có gene thymidine kinase của virus herpes và gene này cấu thành tới 10% của sản phẩm được tổng hợp mới. Retrovirus được dùng một cách tương tự để sản xuất một lượng lớn hormon và protein hữu dụng có thể dùng trong thương mại, bởi dựa vào những tín hiệu biểu hiện tốt chứa trong LTRs của chúng (bảng 6.3).
Dạng thay đổi của cấu trúc vector bao gồm phối hợp những yếu tố có chức phận từ những nguồn khác nhau. Như trong sự phối hợp với gene khởi động tăng cường (enhancer-promotor) cần cho sự phiên mã có hiệu quả hay trong sự phối hợp những đoạn thích hợp có đầu 5’ tận cùng và 3’ của vùng mã hoá protein để làm tăng sự dịch mã cũng như tăng tính bền truyền tin sau khi sao chép xong. Trong trường hợp này, những đơn vị sao chép hoàn toàn được hình thành bởi cung cấp những đoạn mã hoá.
Ngoài ra còn có hai yếu tố nữa có thể làm tăng cường biểu hiện của gene sát nhập vào trong bộ gene đó là:
- Vị trí sát nhập của gene.
Gene được gài vào chromosome một cách ngẫu nhiên, hoặc ở vùng trơ hoặc ở vùng hoạt động. Chẳng hạn các đoạn của β-globin đưa vào dòng tế bào erythroleukemia, chỉ được xác định được một trong số 1000 tế bào bị nhiễm là có chứa đoạn vector sát nhập locus β-globin. Do đó phải có sự sàng lọc và tách dòng có sự tái tổ hợp ở vị trí đặc biệt. Muốn làm được điều này phải có biện pháp để lựa chọn những vị trí sát nhập cho phép biểu hiện ở mức độ cao. Tuy nhiên hiên nay vấn đề này đang còn được nghiên cứu.
- Số lượng bản sao (copy)
Lượng sản phẩm thu nhận được từ những gene được chuyển thường tỷ lệ thuận với số lượng bản copy của gene có mặt, do đó làm tăng số lượng copy của những gene đã được sát nhập là rất cần thiết. Người ta thấy rằng, sự khuyếch đại gene trong
các tế bào nuôi cấy chịu sự tănglượng thuốc độc thì dòng biến đổi của nó được chọn lọc để kháng thuốc hơn so với dòng tế bào hoang dại. Trong phần lớn trường hợp là do sự sản xuất quá nhiều những enzyme có khả năng ức chế tác dụng của thuốc. Sự sản xuất quá nhiều enzyme lại thường do tăng nhiều số lượng
Virus động vật dùng để cấu trúc vector biểu hiện là virus papiloma của bò (BPV), sao chép theo cách thể bổ sung (episome) trong các tế bào nguyên bào sợi (fibroblast) của loài gặm nhấm. Số lượng copy của nó thấp hơn SV 40, nhưng ưu điểm nhất của nó là không giết chết tế bào chủ nên các dòng tế bào bền và có thể dùng để sản xuất. Trong một số trường hợp vector BPV đã được chỉ ra là duy trì epiosome giống con đường của virus nguyên vẹn. Trong nhiều trường hợp khác vector BPV hợp nhất vào tế bào chủ thường như sắp đặt hàng đôi từ đầu đến cuối. Sự phối hợp giữa promotor và enhancer mạnh (như promotor I của metallothionein chuột và enhancer của BPV) đồng thời với số lượng copy cao tương đối sẽ cho sự biểu hiện cao trong các tế bào fibroblast chuột của nhiều các gene.
7.5. Sản xuất protein từ nguồn phế thải
Sản xuất protein từ nguồn phế thải hiện đang là vấn đề thời sự, bởi vì sử dụng nguồn phế thải ngoài ý nghĩa tạo ra các sản phẩm mong muốn dùng trong các lĩnh vực như dược phẩm, chăn nuôi , mỹ phẩm v.v...sử dụng nguồn phế thải còn có ý nghĩa to lớn trong việc xử lý ô nhiễm môi trường. Ở nước ta cũng như trên thế giới hàng ngày có hàng trăm tấn rác thải cần được xử lý. Với ý nghĩa đó chúng tôi xin giới thiệu công nghệ sản xuất một số protein và amino acid từ nguồn phế thải.
7.5.1. Sản xuất cystine và các amino acid
7.5.1.1. Vài nét về ứng dụng của cystine.
Cystine được cấu trúc từ hai phân tử cysteine liên kết với nhau qua cầu disulfua. Gần đây người ta phát hiện thấy cystine có nhiều ứng dụng trong đời sống:
Trong dược phẩm như thuốc chống viêm gan, bảo vệ gan trong nhiễm độc kim loại nặng, chống loạn dưỡng da, chống rụng tóc, chống bệnh nghèo đạm và chống nhiễm độc thai nghén. Ngoài ra cystine còn được dùng làm thuốc chống bỏng da và viêm loét giác mạc, thuốc phòng và điều trị ung thư, thuốc bổ miễn dịch, thuốc
chống xơ hoá và thấp khớp, thuốc chống phóng xạ, phòng chất độc hoá học và hàn gắn nhanh những vết thương, vết mổ v.v...
Đối với mỹ phẩm, cystine được làm thuốc trẻ hóa, thuốc sấy tóc bền, thuốc làm mượt tóc v.v...
Đối với thực phẩm cystine trở thành loại thực phẩm cao cấp, được dùng vào sữa khô, bánh mỳ khô và súp cao cấp.
Với ý nghĩa như vậy, cystine hiện nay trở thành thương phẩm có giá trị trên thị trường Quốc tế, đặc biệt là các nước ở Tây âu và Nhật bản. Riêng ở Nhật mỗi năm tiêu thụ lên tới 500 tấn cystine.
7.5.1.2. Công nghệ sản xuất cystine và amino acid từ nguồn phế liệu.
Trong các công nghệ phổ biến sản xuất amino acid bằng con đường vi khuẩn, nấm men, con đường tổng hợp enzyme, con đường tổng hợp hoá học, thì cystine vẫn đang được tách chiết từ nguồn nguyên liệu giàu cystine và trong năm 1980, thế giới đã sản xuất được 700 tấn dạng L-cystine. ở đây chúng tôi chỉ trình bày việc sản xuất cystine và các amino acid từ nguồn phế liệu là lông gà, lông cánh vịt lông lợn và tóc vụn, Quá trình tách chiết phải trải qua 11 công đoạn sau đây:
Công đoạn 1: Thuỷ phân bằng HCl ở 100oC.
Công đoạn 2: Trung hoà dịch thuỷ phân bằng Na2CO3.
Công đoạn 3: Lắng , lọc và thu tủa.
Công đoạn 4: Hoà tan tủa bằng HCl 5%, thu lấy dịch trong. Công đoạn 5: Xử lý than hoạt tính.
Công đoạn 6: Trung hoà NaOH, thu cystine thô.
Công đoạn 7: Đến công đoạn 11 lặp lại các bước trên để thu được
cystine sạch và cuối cùng phải xác định sản phẩm bằng một trong những phương pháp khác nhau thường sử dụng trong phòng thí nghiệm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bằng công nghệ trên họ đã thu được hàm lượng cystine từ tóc là 6%; từ lông cánh vịt 2,3%; lông gà 3,5% và lông lợn 2,13% (tính theo hàm lượng amino acid tổng số).