6. Ligase (synthetase)
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ENZYME 4.1 Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu enzyme
4.1. Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu enzyme
Enzyme là những chất xúc tác sinh học có bản chất protein và rất không ổn định. Trong những điều kiện bất lợi, chúng không bền, dễ bị biến tính và mất hoạt độ. Do đó, khi nghiên cứu enzyme cần chú ý tránh những điều kiện sau:
- Đa số enzyme hoạt động được ở vùng pH trung tính hoặc gần như trung tính (pH = 7 ± 2). Vì vậy các yếu tố axit mạnh, kiềm mạnh dễ gây biến tính enzyme.
- Khi điều chỉnh pH của dung dịch đệm có chứa enzyme cần phải thêm từ từ và rất thận trọng các axit hoặc kiềm nên tiến hành ở 00C.
- Những ion kim loại nặng như chì, đồng, thủy ngân... và các điều kiện về nhiệt độ cao cũng thường làm mất hoạt độ enzyme.
- Khi tách và làm sạch enzyme, cần tiến hành ở nhiệt độ thấp, thường từ 00C đến 50C. Đối với các enzyme không bền thì được tiến hành ở nhiệt độ thấp hơn (từ - 50C đến - 200C). Người ta hay sử dụng các hỗn hợp lạnh như nước đá với CO2 hoặc nước đá với muối NaCl, hoặc thậm chí dùng cả hỗn hợp nước đá với axit sulfuric đậm đặc...
Bảng 4.1. Hỗn hợp làm lạnh
- Tránh tạo bọt vì nhiều enzyme bị biến tính (mất hoạt tính) ở mặt phân cách hai pha nước và khí. Do vậy, người ta thường rót dung dịch enzyme theo thành ống thủy tinh và không được lắc.
- Khi cắt, thái, xay nhỏ các mẫu thực vật và động vật (lá cây, thịt, các cơ quan nội tạng...) không dùng các dụng cụ dao kéo, dụng cụ xay đã han rỉ để tránh tác dụng của các ion kim loại nặng như (Cu, Pb, Fe...) mà nên dùng dụng cụ inox.
- Khi dùng các dung môi hữu cơ như aceton, alcol để kết tủa enzyme cần tiến hành ở nhiệt độ thấp. Thành phần hỗn hợp Tỷ lệ Nhiệt độ đạt được Nước đá: muối 100:33 (3:1) - 21,30C Nước đá: H2SO4 đậm đặc 100: 25 (4:1) - 20,00C
- Tách kết tủa enzyme bằng cách ly tâm lạnh tốt hơn lọc lạnh vì tiến hành nhanh hơn, và cần thực hiện thí nghiệm liên tục, không ngắt quãng để tránh giảm hoạt độ của enzyme.
- Khi tiến hành xác định hoạt độ của các enzyme, nếu đã xác định trong khoảng nhiệt độ nào thì tất cả các thành phần của hỗn hợp phản ứng phải được giữ ở nhiệt độ ấy (dùng máy ổn định nhiệt). Khi hỗn hợp phản ứng đã đạt được nhiệt độ cần thiết thì mới tiến hành đo và pH cần giữ ổn định, chính xác.
- Để đảm bảo kết quả tin cậy, tránh sai số nhiều, phải lấy thật chính xác lượng dịch enzyme, thường dùng các loại micropipette.
- Trong khi thí nghiệm cần chú ý tránh đánh rơi enzyme vào dung dịch nghiên cứu. Ví dụ, đang làm thí nghiệm với amylase chẳng hạn thì không nói chuyện nhiều.
- Khi đã có chế phẩm enzyme, cần bảo quản chúng ở nhiệt độ thấp, giữ các kết tủa ở dạng huyền phù trong dung dịch ammoni sulphate bão hòa và lấy chế phẩm ra bằng cách ly tâm.
- Sấy khô chế phẩm enzyme ở điều kiện chân không hoặc dùng phương pháp đông khô.