6. Ligase (synthetase)
4.2. Tách và làm sạch (tinh chế) enzyme
4.2.1 Nguồn nguyên liệu
Enzyme có trong tất cả các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật. Một số nguyên liệu thường dùng làm nguồn nguyên liệu để tách enzyme như:
4.2.1.1 Nguồn thực vật
Enzyme hay có mặt ở các cơ quan dự trữ như hạt, củ, quả, lá. Cơ quan dự trữ giàu chất gì thì nhiều enzyme chuyển hóa chất ấy.
- Hạt thầu dầu (tách lipase)
- Hạt đậu tương (tách enzyme urease).
- Hạt lúa, thóc đại mạch nảy mầm (tách α - amylase) - Củ khoai lang (tách β - amylase)
- Nhựa đu đủ xanh (tách papain)
- Các bộ phận (lá, thân, quả) cây dứa ( tách bromelain) - Dịch ép thân và lá cây Ficus (tách fixin)
Trong tất cả các nguyên liệu có nguồn gốc động vật thì tuyến tụy, màng nhầy dạ dày, tim, gan, lá lách... dùng để tách enzyme rất thuận lợi.
- Tụy tạng giàu enzyme nhất có thể dùng để tách trypsine, amylase, lipase, protease, ribonuclease và một số enzyme khác.
- Từ ngăn tư của dạ dày bê nghé có thể thu nhận chế phẩm renin để làm đông sữa trong sản xuất fomat. Người ta cũng sản xuất pepsin từ dạ dày động vật. Nhưng khác với pepsin, renin có khả năng đông tụ sữa cao mà không thủy phân sâu sắc casein. Renin là chế phẩm enzyme có giá trị lớn trong công nghiệp
Nguyên liệu động vật dùng để tách enzyme phải tươi tốt lấy ngay sau khi động vật vùa bị giết chết hoặc bảo quản ở nhiệt độ 200C
4.2.1.3 Nguồn vi sinh vật
Vi sinh vật thường dùng để sản xuất chế phẩm enzyme gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clostridium, Streptomyces và một số loài nấm men.
Trong các nguồn nguyên liệu, vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp. Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi ích chính như sau:
- Có thể chủ động về nguồn nguyên liệu.
- Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn (từ 16 - 100 giờ) do đó có thể thu hoạch hàng trăm lần trong năm.
- Enzyme vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác. Vì vậy chỉ cần một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất.
- Có thể điều khiển sự tổng hợp enzyme dễ dàng hơn các nguồn nguyên liệu khác để tăng lượng enzyme được tổng hợp hoặc tổng hợp định hướng enzyme.
- Giá thành thấp vì môi trường nuôi cấy vi sinh vật tương đối đơn giản, rẻ tiền,...
Tuy nhiên cần lưu ý một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố, vì vậy cần có biện pháp xử lý thích hợp.
Để sản xuất các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật bao gồm các giai đoạn chủ yếu sau:
- Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống: người ta tiến hành phân lập từ môi trường nhiên hoặc gây đột biến bằng các phương pháp sinh học, lý, hóa học... để tạo chủng có khả năng siêu tổng hợp enzyme.
- Lựa chọn môi trường nuôi cấy vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật
- Nuôi cấy vi sinh vật: có hai phương pháp nuôi cấy khác nhau về nguyên tắc + Phương pháp nuôi cấy bề mặt: vi sinh vật phát triển và bao phủ trên
bề mặt môi trường dinh dưỡng rắn, đã được làm ẩm và vô trùng. Chế phẩm thu được ở dạng rắn - thô.
+ Phương pháp nuôi cấy bề sâu: vi sinh vật phát triển trong môi trường lỏng có sục khí và khuấy đảo liên tục, thu được canh trường lỏng - dạng thô.
- Tách và tinh chế enzyme: để thu chế phẩm tinh khiết
4.2.2 Thu hồi chế phẩm enzyme
Enzyme có mặt trong mọi tế bào cơ thể sống. Các enzyme có thể tiết ra ngoài môi trường (enzyme ngoại bào) hoặc cư trú bên trong tế bào (enzyme nội bào)
Đối với enzyme nội bào: muốn chiết rút enzyme ra khỏi tế bào cần:
- Phá vỡ cấu trúc tế bào bằng nhiều phương pháp như cơ học (nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa), dùng tác dụng của sóng siêu âm, của các dung môi hữu cơ (butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate...)
- Sau đó, enzyme được chiết bằng các dung môi khác nhau như nước cất, dung dịch đệm thích hợp, dung dịch muối trung tính…
- Trong dịch chiết, ngoài enzyme còn có các protein tạp và nhiều chất khác, để loại bỏ chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác nhau.
+ Để loại bỏ muối khoáng và các tạp chất có phân tử lượng thấp (các loại đường…) thường dùng các phương pháp thẩm tích đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng (cách làm: cho dung dịch enzyme vào túi colodion hoặc cellophane (thông thường người ta dùng cellophane tốt hơn), sau đó đặt cả túi vào nước cất hoặc dung dịch đệm pha loãng (như đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M chẳng hạn).
Màng cellophane là màng bán thấm, có kích thước lỗ cho các chất có phân tử nhỏ xuyên và đi qua vào các dung dịch đệm loãng theo định luật khuếch tán. Còn lại trong màng là các chất protein có phân tử lớn) (Hình 4.1) hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex.
+ Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) và các tạp chất có phân tử lượng cao khác, thường dùng kết hợp các phương pháp khác nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel.
Phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt hoặc pH của môi trường chỉ dùng đối với trường hợp các enzyme bền với nhiệt hoặc bền với acid. Dịch enzyme được giữ ở 50 - 700C hay ở pH = 5 trong một thời gian xác định sau đó protein đã bị biến tính được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm.
Hình 4.1. Thẩm tích để loại muối (NH4)2SO4 trong kết quả protein
Đối với enzyme ngoại bào: để thu dịch enzyme thường tách sinh khối và các chất cặn bã ra khỏi canh trường bằng ly tâm hoặc lọc ép với việc sử dụng thêm các chất trợ lọc (diatomit, than hoạt tính…) hoặc các chất tạo kết tủa khi cần thiết (CaCl2 + (NH4)2SO4 CaSO4, chất này dễ dàng bị lắng cặn kéo theo sinh khối nên giúp cho quá trình lọc sẽ dễ dàng hơn)
Cho đến nay vẫn chưa tìm được phương pháp tách và làm sạch chung cho các enzyme. Khi cần tách và làm sạch một enzyme nào đó cần chọn và phối hợp các phương pháp khác nhau để xây dựng một phương pháp phù hợp nhất.
Trong quá trình chiết rút, cần chú ý:
- Phải chiết rút và tiến hành kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (từ 3 đến 50C) - Các thao tác thí nghiệm phải nhanh
- Dùng chất điện ly thích hợp: (NaCl, ZnCl2, CaCl2) phụ thuộc vào phương pháp dùng khi chiết rút. Ví dụ, dùng máy nung thì cả ba chất trên đều có tác dụng, nếu chỉ để lắng thì chỉ NaCl có tác dụng.
- Ở động, thực vật, còn có ảnh hưởng của chất màu đến việc làm sạch hoặc xác định hoạt độ enzyme. Vì vậy, người ta cho thêm vào chất khử để loại màu.
Ví dụ:
+ Màu của hemoglobin ở hồng cầu hoặc của chlorophyll và một số chất màu khác ở lá có thể bị loại trừ bởi hỗn hợp ethanol, chloroform với tỷ lệ thích hợp.
+ Hoạt độ enzyme superoxide dismutase (SOD) - một enzyme chống ôxy hóa có thể xác định sau khi đã loại màu khỏi dịch chiết enzyme. + Ở các mẫu từ động vật có sắc tố melanin màu nâu thường loại màu
trên cột nhựa trao đổi ion bằng cách cho dịch enzyme qua cột hoặc lắc. Khi qua cột, chất màu bị giữ lại và enzyme không bị giữ. Người ta hay dùng DEAE - cellulose (Diethylamino ethyl - cellulose) hoặc than hoạt tính. Trong quá trình này phải chú ý kiểm tra pH. Sau khi loại màu cần kiểm tra lại hoạt độ của enzyme.
Sau khi làm sạch cần sấy khô các chế phẩm enzyme (sấy chân không ở nhiệt độ thấp hoặc sấy thăng hoa) để có thể sử dụng lâu dài. Bằng các phương pháp làm sạch khác nhau có thể thu được các chế phẩm enzyme có hoạt tính cao hơn nhiều so với chế phẩm ban đầu.
Việc thu chế phẩm enzyme tinh khiết và nhất là ở dạng tinh thể rất khó khăn và tốn kém do đó các chế phẩm enzyme loại này chỉ được dùng trong học và trong mục đích nghiên cứu như xác định khối lượng phân tử enzyme, nghiên cứu về cấu trúc enzyme…