Quá trình phát triển in vitro của trứng dê ựược diễn ra trong môi trường nuôi như ựã ựề cập bên trên. Toàn bộ ựĩa nuôi ựược ựặt trong tủ nuôi có ựiều chỉnh nhiệt ựộ và nồng ựộ khắ CO2. Thông thường, nồng ựộ khắ CO2 của tủ nuôi ựược ựặt là 5%. đây là nồng ựộ thắch hợp, tạo ựiều kiện cho trứng phát triển in vitro.
Tuy nhiên trên thực tế, Trứng phát triển trong buồng trứng con vật, trong ựó lượng oxy trong mô bào thấp (khoảng 5%). Mặt khác, lượng oxy trong không khắ cao (khoảng 20%) nên việc hòa tan vào dung dịch nuôi trứng trong tủ nuôi là lớn. Chắnh vì vậy sự tác ựộng của oxy lên quá trình phát triển của trứng nuôi trong ựiều kiện in vitro sẽ khác với trong thực tế tại buồng trứng của con vật.
Nếu hạ nống ựộ oxy trong tủ nuôi xuống thấp thì có thể sẽ khắc phục ựược ựiểm này. Dựa trên cơ sở trên chúng tôi tiến hành thắ nghiệm nuôi trứng trong tủ nuôi có nồng ựộ oxy ựược hạ xuống còn 5%.
Kết quả so sánh khả năng thành thục của trứng dê nuôi ở hai môi trường nuôi có nồng ựộ oxy khác nhau ựược trình bày ở bảng và biểu ựồ 7.
Bảng 7. Tỷ lệ thành thục của trứng dê nuôi trong hai môi trường có nồng ựộ oxy khác nhau
điều kiện 5%CO2 + 20%O2 điều kiện 5%CO2 + 5%O2 Lô thắ
nghiệm Nsd (n) Ntt (n) %tt (%) Nsd (n) Ntt (n) %tt (%)
1 21 11 52,38 32 28 87,50
2 32 19 59,38 28 24 85,71
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 55
4 25 15 60,00 36 29 80,56
Tổng 102 61 59,61 + 5,84 a 165 93 77,92 + 13,67 b
Ghi chú: Ntt (số trứng thành thục), Nsd (Số trứng sử dụng), %tt (Phần trăm trứng thành thục), a, b (Giá trị khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05))
Biểu ựồ 7. Tương quan tỷ lệ thành thục của trứng dê nuôi trong hai ựiều kiện oxy khác nhau
Từ kết quả ở bảng 7 và biểu ựồ 7 cho thấy: Tỷ lệ trứng phát triển ựến giai ựoạn thành thục ở lô trứng nuôi trong ựiều kiện thấp oxy (5%CO2+5%O2) là cao hơn (P<0,05) so với lô trứng nuôi trong ựiều kiện 5%CO2+20%O2.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 56
Việc nuôi trứng ở ựiều kiện thấp O2 là khá tốn kém, ựầu tiên phải có một tủ nuôi có cả chức năng ựiều chỉnh và hiển thị nồng ựộ CO2 và cả O2, tiếp ựó phải hạ thấp O2 bằng cách sử dụng khắ Nitơ. đây chắnh là một cản trở lớn khi triển khai thắ nghiệm.
Tuy nhiên, trong những trường hợp cần thiết phải có ựược các trứng thành thục với hiệu quả cao hơn (dùng cho mục ựắch tạo phôi nhân bản, chuyển genẦ) thì việc sử dụng mô hình thấp O2 vẫn là một giải pháp có thể tắnh ựến.
Kết quả của chúng tôi phù hợp với công bố của tác giả (Singh và cs, 2009). Các tác giả này nhận thấy: khi nồng ựộ O2 giảm xuống còn 10% thì hiệu quả thu trứng thành thục là cao hơn nồng ựộ O2 là 20% (P<0,05). điều này một lần nữa cho thấy việc duy trì nồng ựộ O2 thấp trong in vitro là có lợi cho sự phát triển của các tế bào, trứng và phôi tạo ra sau này.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 57
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
Ớ đã xây dựng thành công phương pháp thu, bảo quản buồng trứng dê, khai thác trứng dê từ nang trứng và phân loại chất lượng trứng dê thông qua ựánh giá hình thái lớp tế bào cumulus bao quanh.
Ớ đã xây dựng thành công phương pháp tách hoàn toàn lớp tế bào cumulus của trứng dê sau nuôi thành thục bằng việc sử dụng enzym Hyaluronidaza (1,0 mg/ml; 370C, 120 Ờ 180 giây) kết hợp phương pháp tách cơ học (hút lên xuống bằng pipet thủy tinh có ựường kắnh trong là 130-150 ộm).
Ớ đã xây dựng thành công phương pháp nuôi trứng dê thành thục trong ống nghiệm với các thông số sau:
a/ Tỷ lệ trứng dê thành thục trong môi trường TCM199 có bổ sung FSH ở nồng ựộ 0,1 và 0,2 ộg/ml (54,98 + 9,57 % và 58,57 + 4,59 %) cao hơn (P<0,05) so với môi trường có FSH ở nồng ựộ 0,05 ộg/ml (39,53 + 9,13%); b/ Tỷ lệ trứng dê thành thục trong môi trường TCM199 có bổ sung FSH ở nồng ựộ 0,1 ộg/ml, 5%CO2+5%O2, 390C (77,92 + 13,67 %) cao hơn (P<0,05) so với nuôi trong môi trường TCM199 có bổ sung FSH ở nồng ựộ 0,1 ộg/ml, 5%CO2+20%O2, 390C (59,61 + 5,84 %).
5.2. đề nghị
Tiến hành các bước tiếp theo của công nghệ sinh sản trên con dê sau khi ựã nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm (IVM) như: Thụ tinh trong ống nghiệm (In Vitro Fertilization - IVF), bơm tinh trùng vào trứng (Intracytoplasmic Sperm Injection - ICSI), tạo dòng phôi (Embryo Cloning - EC), chuyển phôi (Embryo Transfer - ET)Ầ
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tham khảo trong nước
1. đặng Xuân Biên (1979), Kết quả ựiều tra giống dê và cừu, Trong kết quả nghiên cứu KHKT 1969 - 1979, Viện chăn nuôi, Nhà xuất bản nông nghiệp 1985.
2. đinh Văn Bình (1994), Nghiên cứu một số ựặc ựiểm sinh học và khả năng sản xuất của giống dê Bách Thảo nuôi tại miền Bắc Việt Nam,
Luận án PTS khoa học nông nghiệp, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam.
3. đinh Văn Bình và cộng sự (1998), Kết quả nghiên cứu thắch nghi ba giống dê Ấn độ Barbari, Jumnapari, Beetal qua 4 năm nuôi tại Việt Nam (1994-1998), Trung tâm Nghiên cứu Dê và Thỏ Sơn Tây; 8-40.
4. đinh Văn Bình, Nguyễn Duy Lý (2003), Kỹ thuật chăn nuôi dê lai sữa - thịt ở gia ựình, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
5. Nguyễn Văn Bình, Trần Trang Nhung (2008), ỘKhả năng sinh sản của dê núi nuôi tại huyện Vị Xuyên tỷnh Hà GiangỢ, Tạp chắ KHKT Chăn nuôi, số 9 Ờ 08. 6. Cù Xuân Dần (1996), Giáo trình sinh lý gia súc, NXB Nông nghiệp Hà Nội. 7. Hồ Quảng đồ, ỘTình hình sản xuất và tiêu thụ sản phẩm của dêỢ, Chăn nuôi dê, http://thuvien.maivoo.com/Khoa-hoc-c9/Chan-Nuoi-De-Bai-1-Tinh- Hinh-San-Xuat-Va-Tieu-Thu-San-Pham-Cua-De-d5630.
8. Hồ Quảng đồ, ỘGiống và công tác giống dêỢ,Chăn nuôi dê, http://thuvien.maivoo.com/Khoa-hoc-c9/Chan-Nuoi-De-Bai-2-Giong-Va- Cong-Tac-Giong-De-d39222.
9. Nguyễn Hữu đức (2005), Nghiên cứu nuôi thành thục và thụ tinh ống nghiệm trứng bò nội tại Việt Nam, Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp Ờ chuyên ngành: Sinh sản và thụ tinh nhân tạo, Mã số: 4 Ờ 03 Ờ 07. Trường đại học
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 59
Nông nghiệp Hà Nội.
10. Nguyễn Hữu đức, Giang Hoàng Hà, Trần Thị Bình Nguyên (2011), ỘPhân tách tế bào cumulus của trứng dê bằng cách sử dụng enzym HyaluronidazaỢ, Tạp chắ khoa học và phát triển Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội, tập 9, số 4 Ờ 2011; 578 Ờ 583.
11. Nguyễn Thị Mai (2000), Nghiên cứu chọn lọc, nhân thuần dê Bách Thảo và lai với các giống dê ngoại nhập, Luận án Tiến sỹ Nông Nghiêp, Viện Nghiên cứu Khoa học Nông Nghiệp miền Nam.
12. Nguyễn Bá Mùi (2011), ỘDùng ựực giống Boer ựể cải tạo ựàn dê tại tỷnh Yên BáiỢ, Hội thảo tổng kết nghiên cứu khoa học kỷ niệm 55 năm thành lập Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội, Khoa Chăn nuôi và NTTS, đại học Nông nghiệp Hà Nội.
13. Nguyễn đình Rao, Thanh Hải, Nguyễn Thiệu Trường (biên dịch) (1979),
Nuôi dê, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
14. Lê Văn Thông (2005), Nghiên cứu một số ựặc ựiểm của giống dê Cỏ và kết quả lai tạo với dê Bách Thảo tại vùng Thanh Ninh, Luận án Tiến sỹ khoa học Nông Nghiệp, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông Nghiệp Việt Nam, Văn điển, Hà Nội; 95; 100; 111-113; 117-121.
15. Mai Hữu Yên (1998), điều tra thực trạng ựàn dê tại huyện định Hóa và ảnh hưởng của việc thay ựổi ựực giống ựến khả năng sản xuất của dê ựịa phương, Luận án Thạc sĩ, Trường đại học Nông lâm, Thái Nguyên.
16. Báo cáo của khoa Thú y về Tình hình chăn nuôi dê cừu và ựịnh hướng phát triển ựến năm 2015, (8/2/2008), Trường đại học Nông Lâm Huế.
17. Báo cáo tổng kết về công nghệ hỗ trợ sinh sản, (2008), Trường đại học quốc gia thành phố Hồ Chắ Minh.
18. ỘCác giống dê nộiỢ (2011), Mạng Thú y Việt Nam, http://vnvet.net/vi/news/Tin-tuc/Giong-De-Noi-469/
19. ỘCác giống dê ngoại chuyên thịt, kiêm dụngỢ (2011), Mạng Thú y Việt Nam, http://vnvet.net/vi/news/Tin-tuc/Giong-de-ngoai-chuyen-thit-Kiem-dung-471/
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 60
20. ỘCác giống dê ngoại chuyên sữaỢ,(2011), Mạng Thú y Việt Nam, http://vnvet.net/vi/news/Ban-tin-chan-nuoi/Giong-de-ngoai-Chuyen-sua-470/
Tài liệu tham khảo nước ngoài
21. A.I.Younis, K.A.Zuelke, K.M.Harper, M.A.I.Oliveira and B.G.Brackett (1991), ỘIn vitro Fertilization of goat oocytesỢ. Biology of reproduction, Vol 44; 1177 Ờ 1182.
22. Alberto Revelli, Luisa D Piane, Simona Casano, Emanuela Molinari, Marco Massobrio and Paolo Rinaudo (2009). Follicular fluid content and oocyte quality: from single biochemical markers to metabolomics.
Reproductive Biology and Endocrinology,: 40 doi: 10.1186/ 1477-7827-7-40. 23. Amoah. E. A. and S. Gelaye (1997), ỘBiotechnological advances in goat reproductionỢ, Journal of animal science 1997, 75; 578 Ờ 585.
24. Anguita B, Jimenez-Macedo AR, Izquierdo D, Mogas T, Paramio MT (2007), ỘEffect of oocytes diameter on meiotic competence, embryo development, p34(cdc2) expression and mpf activity in prepubertal goat oocytesỢ. Theriogenology 67; 526-536.
25. Baldessarre H, Karatzas CN (2004), ỘAdvanced assisted reproduction technologies (ART) in goatsỢ, Anim. Reprod. Sci. 82-83; 255-266.
26. Callesen H., Greve T., Christensen F. (1987), ỘUltrasonically guided aspiration of bovine follicular oocytesỢ, Theriogenology, 27, 217.
27. Y.Congnié, G. Baril, N. Poulin, P.Mermillod (2003). ỘCurrent status of embryo technologies in sheep and goatỢ, Theriogenology Ờ An International Journal of Animal reproduction: Vol 59; 171 Ờ 188.
28. Chian R.C, Chung J.T., Downey B.R., Tan S.L. (2002), ỘMaturational and developemental competence of immature oocytes derived from bovine ovaries at different phases of folliculogenesisỢ. Reprod Biomed Online, 4 (2); 127-132.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 61
29. De Loos F., Van Vliet C., Van Maurik P., Kruip T.A.M. (1989),
Morphology of immature bovine oocytes, Gamete Research, 24; 197 Ờ 204. 30. Devendra, C and Marca Burns (1983), Goat production in the tropics. Common weath agricultural Bureaux. Farnham-house, Farnham-Royal. Slough SL 23BN.UK.
31. Devendra C. and Mcleroy (1987), Milk prodution and reproduction, Goat and Sheep production in the Tropics, pp. 7-51; 97-99.
32. Donney I., Van Langendonckt A., Anquier P., Grisart B., ansteenbugge A., Massip A., Dessy F. (1997), ỘEffects of co-culture and embryo number on the in vitro development of bovine embryosỢ, Theriogenology, 47; 1549 Ờ 1561.
33. E.R.González, M.L.Bejar, D.Izquierdo and M.T.Paramio (2003) ỘDevelopemental competence of prepubertal goat oocytes selected with brilliant cresyl blue and matured with cysteamine supplementationỢ, Pubmed: 712956317; 179 Ờ 187.
34. Elena Sogorescu, Stela Zamfirescu, Andreea Hortanse Anghel and Dorina Nadolu (2010), ỘThe influence of new media on the developemental Competence of goat and sheep oocytesỢ, Romanian Biotechnological letters Ờ University of Bucharest, Vol 14, No 3, 2010.
35. Fukuda Y., Ichikawa.M., Naito.K., Toyoda.Y, (1990), ỘBirth of normal calves sedulting from bovine oocytes matured, fertilized and cultured with cumulus cells in vitro up to the blastocyt stageỢ, Biology of reproduction, 42; 114 Ờ 119.
36. Fukushima M. and Fukui Y. (1985), ỘEffects of gonadotropin and steroids on the subsequent fertilizability of extrafollicular bovine oocytes cultured in vitroỢ, Animal Reproduction Science, 9, 323 Ờ 332.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 62
ỘEmbryo production by ovum pic up from live donorsỢ, Theriogenology, 55; 1341 Ờ 1357.
38. Garcắa-Roselló E, Garcắa-Mengual E, Coy P, Alfonso J, Silvestre MA. (2009), Intracytoplasmic sperm injection in livestock species: an update,
Reprod Domest Anim., 44(1); 143-51.
39. Guo J, An Z, Li Y, Li X, Li Y, Guo Z, Zhang Y. (2002), Cloned goats (Capra hircus) from adult ear cells, Sci China C Life Sci., 45(3): 260-7.
40. Han D, Zhao BT, Liu Y, Li JJ, Wu YG, Lan GC, Tan JH (2008), ỘInteractive effects of low temperature and roscovitine (ROS) on meiotic resumption and developmental potential of goat oocytesỢ. Mol. Reprod. Dev.
75; 838-846.
41. Hazeleger N.L., Hill D.J., Stubbings R.B., Walton J.S. (1995), ỘRelationship of morphology and follicular fluid environment of bovine oocytes to their developmental potential in vitroỢ, Theriogenology, 43; 509 Ờ 522.
42. Herrick JR, Behboodi E, Memili E, Blash S, Echelard Y, Krisher RL (2004), ỘEffect of macromolecule supplementation during in vitro maturation of goat oocytes on developmental potentialỢ, PUBMED 15349846, Mol reprod dev, Nov; 69(3) 338 Ờ 46.
43. Izquierdo D, Villamediana P, López-Bejar M, Paramio MT. (2002), ỘEffect of in vitro and in vivo culture on embryo development from prepubertal goat IVM-IVF oocytesỢ. Theriogenology, 57(5): 1431-41.
44. Keskintepe L., Burnley C.A., Brackett B.G. (1975), ỘProduction of viable bovine blastocysts in defined in vitro conditionsỢ, Biology of reproduction, 52; 1410-1417.
45. Keskintepe L, Darwish GM, Younis AI, Brackett BG (1994), ỘIn vitro
development of morulae from immature caprine oocytesỢ Pubmed: 7874460; 97 Ờ 102.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 63
46. Lan GC, Chang ZL, Luo MJ, Jiang YL, Han D, Wu YG, Han ZB, Ma SF, Tan JH. (2006), ỘProduction of cloned goats by nuclear transfer of cumulus cells and long-term cultured fetal fibroblast cells into abattoir- derived oocytesỢ,Pubmed 16572465, Mol Reprod Dev. 73(7); 834-40.
47. Leibfried L., First N.L. (1979), ỘCharacterization of bovine follicular oocytes and their ability to mature in vitroỢ, J. Anim. Sci., 48; 76 Ờ 86.
48. Liu W, Yin Y, Long X, Luo Y, Jiang Y, Zhang W, Du H, Li S, Zheng Y, Li Q, Chen X, Liao B, Xiao G, Wang W, Sun X (2009) Derivation and characterization of human embryonic stem cell lines from poor quality embryos. J. Genet Genomics 36; 229-239.
49. Lunovic GC (2000) Current progress on assisted reproduction in dogs and cats: in vitro embryo production. Reprod Nutr Dev 40; 505-512.
50. M.Khatun, M.M.U.Bhuiyan, J.U.Ahmed, A.Haque, M.B.Rahman, M.Shamsuddin (2010) ỘIn vitro maturation and fertilization of prepubrertal and pubertal black Belgal goat oocytesỢ, Journal of Veterinary Science, vol 12; 75 Ờ 82.
51. M.T.Paramio (2010). ỘIn vitro and In vivo embryo production in goatỢ,
Small Ruminant Research (ELSEVIER), vol 89; 144 Ờ 148.
52. Martino A, Mogas T, Palomo MJ, Paramio MT. (1995), ỢIn vitro
maturation and fertilization of prepubertal goat oocytesỢ. Theriogenology, 43(2):473-85.
53. Mizushima .S, Fukai.Y. (2000), ỘFertilizability and developemental capacity of bovine oocytes cultured individually in a chemically defined maturation mediumỢ, Theriogenology, 55; 1431 Ờ 1445.
54. N.Crozet, M.Ahmed Ờ Ali and M.P.Dubos (1995). ỘEvelopmental competence of goat oocytes from follicles of different size categories following maturation, fertilization and culture in vitroỢ, Journal of
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 64
Reproduction and fertility, Vol 103; 293 Ờ 298.
55. P.Tajika, N.Shams Esfandabadib (2002), ỘIn vitro maturation of caprine oocytes in different culture mediaỢ, Small Ruminant research, the official jurnal of the International Goat association, Vol 47, Issue 2; 155 Ờ 158, Feb 2003.
56. Paloma Duque, Enrique Gomez, Elena Diaz, Nieves Facal, Carlos Hidalgo, Carmen Diez (2003), ỘUse of two replacements of serum during bovine embrio culture in vitroỢ, Theriogenology, 59; 889-899.
57. Pieterse M.C., Kappen K.A., Kruip ThA.M., Taverne M.A.M. (1988), ỢAspiration of bovine oocytes during transvaginal ultrasound scanning of the ovariesỢ, Theriogenology, 30; 751 Ờ 761.
58. S.D.Kharche, A.K.Goel, S.K.Jindail and N.K.Sinha (2006), ỘIn vitro
maturation of caprine oocytes in different concentration of estrous goat serumỢ, Small Ruminant Research (ELSEVIER), vol 64; 186 Ờ 189.
59. Singh.N.S. and Sengar.O.P.S. (1985), ỘStudies on the combinating ability of disable characters of important goat breedsỢ. Final Technical Report, (PL-480 research project on goats, Department of Animal Husbandry and Dairying, R.B.S. College, AGRA-282002; U.P. College VARANASI - 221002).
60. Singh R.K., Das B.C., Majumdar A.C., Sadhan Bag (2009). ỘSimulation of body temperature and different gaseous phase on in vitro maturation and embryo development in goatỢ, Indian Journal of Animal Sciences, 79 (11); 245-251.
61. Wang Z.K., Wei P.H., Lei C., Wang D.Q., Yu D.Q. and Kong M.Q. (1995), ỘDevelopemental capacity and nuclear changes of bovine oocytes from ovaries stored for varied times and temperaturesỢ, Theriogenology, 43, 247.
62. Wieczorek, J. Kosenjuk, J. Cegła, M. Katska-Ksiazkiewicz, L. (2009), ỘEfficacy of laparoscopic method OPU in goatsỢ, Journal: Medycyna Weterynaryjna 2009, Vol. 65 No. 4 pp. 272-276, ISSN: 0025-8628.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 65
CR1aa medium on in vitro maturation, fertilization and early embryo development of goat oocyteỢ, IJ Biotech, June 2003; 621 Ờ 626.