Buồng trứng ựược thu ngay khi con vật bị chết, rửa sạch 3 Ờ 5 lần bằng dung dịch nước muối sinh lý ở ựiều kiện nhiệt ựộ 250C, 300C, 370C. Sau ựó, chúng ựược bảo quản và vận chuyển về phòng thắ nghiệm trong môi trường Phosphate Buffered Saline (PBS) trong thiết bị chuyên dụng Cryologic (hình 1) ở ựiều kiện nhiệt ựộ 250C, 300C, 370C.
Môi trường PBS (dùng pha 01 lắt) có thành phần như sau:
Hóa chất Khối lượng Hóa chất Khối lượng
NaCl 8gr Glucose 01 gr Na2HPO4 1,15 gr Na Pyruvat 0,036 gr CaCl2.2H2O 0,1 gr Penicilin 100000 UI KCl 0,2 gr Streptomycin 0,05 gr KH2PO4 0,2gr BSA 04 gr MgCl2.6H2O 0,1 gr 3.2.3. Thu trứng từ buồng trứng Phương pháp hút trực tiếp
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 34
Buồng trứng về ựến phòng thắ nghiệm ựược rửa lại 04 lần bằng môi trường PBS ở 370C. Dùng bơm tiêm loại 5ml chọc hút trực tiếp các nang trên bề mặt buồng trứng. Phần hút ra gồm dịch nang, trứng và các loại tế bào khác ựược chuyển vào ựĩa NUNC (ựường kắnh 35mm) có chứa môi trường TCM199-Hepes ựã bổ sung 5% Fetal Bovine Serum (FBS) và kháng sinh Penicilin (100.000 UI/lắt), Streptomycin (0,05gr/lắt).
đĩa NUNC nói trên ựược ựặt lên kắnh hiển vi Nikon SMZ1000 (có bàn ấm 370C)(Hình 6) và soi tìm trứng ở ựộ phòng ựại 20 Ờ 80 lần. Trứng tìm thấy sẽ ựược chuyển sang ựĩa NUNC khác có chứa môi trường TCM199-Hepes. Toàn bộ quá trình thao tác trên ựược thực hiện trong tủ hút vô trùng Labconco (hình 3).
Phương pháp cắt lớp
Buồng trứng ựược rửa bằng dung dịch PBS (Phosphate Buffered Saline) ấm (370C).
Trứng trong các nang ựược thu bằng cách cắt lớp buồng trứng (dùng dao mổ cắt thành các ựường song song trên khắp bề mặt buồng trứng). Khi cắt, buồng trứng ựược ngâm trong môi trường TCM199-Hepes (Sigma). Trứng ựược giải phóng khỏi buồng trứng ựược soi tìm trên kắnh hiển vi soi nổi Nikon SMZ1000.
Quá trình soi tìm trứng trên kắnh hiển vi ựược tiến hành trong buồng cấy vô trùng Labconco (Mỹ) và trên kắnh hiển vi luôn luôn có bàn ấm 370C Tokai Hit (Nhật Bản). Chỉ những trứng có chất lượng tốt (lớp tế bào cummulus bao quanh trứng là dày ựặc và ựầy ựặn) mới ựược sử dụng cho các nghiên cứu nuôi in vitro tiếp theo.
3.2.4. Nuôi thành thục trứng in vitro
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 35
Phương pháp nuôi thành thục trứng trong nghiên cứu này dựa vào phương pháp của (Izquierdo và cs, 2002) có cải tiến.
Trứng sau khi ựược rửa qua 04 ựĩa NUNC có chứa môi trường TCM199-Hepes, chúng ựược chuyển vào giọt nuôi (50ộl) có chứa môi trường TCM199 ựã bổ sung 0,25mM Natri Pyruvate, 10% (v/v) Fetal Bovine Serum (FBS), 0,05ộg/ml Follicle Stimulating Hormon (FSH), 05ộg/ml Luteinizing Hormon (LH), 01 ộg/ml Oestradiol.
Các giọt nuôi trứng nói trên ựược phủ dầu khoáng (Sigma-M8410) và cân bằng trong tủ nuôi có ựiều chỉnh 390C, 5% CO2(hình 12), khắ bão hòa hơi nước trước khi dùng từ 1-2 giờ.
Thời gian nuôi trứng trong ựiều kiện tủ nuôi như trên kéo dài 32 giờ. Sau ựó, trứng ựược lấy ra khỏi môi trường nuôi và chuyển vào môi trường TCM199-Hepes ựể tiến hành các thao tác tách tế bào cumulus tiếp theo.
Phương pháp nuôi 02
Phương pháp nuôi thành thục trứng ựược cải tiến dựa trên phương pháp của (M.Khatun và cs, 2010).
Trứng dê (2 Ờ 5 trứng) ựược nuôi in vitro trong 50 ộl môi trường TCM199 (TCM199, EarleỖs salt with L-Glutamine and NaHCO3, Sigma, USA) có bổ sung LH (05 ộg/ml), Oestradiol (01 ộg/ml), Gentamycin (50 ộg/ml), FBS (10% v/v), Natri Pyruvate (0,25mM) và FSH với các nồng ựộ khác nhau (0,05; 0,1; 0,2 ộg/ml).
Các giọt môi trường ựược phủ dầu khoáng và chứa trong ựĩa NUNC 35mm. Toàn bộ ựĩa nuôi có chứa môi trường ựược cân bằng ắt nhất 02 giờ trong tủ nuôi Sanyo (Nhật Bản) ở ựiều kiện 5%CO2, 390C, ựộ ẩm bão hòa. Khắ hóa lỏng CO2 và N2 sử dụng cho các thắ nghiệm ựược cung cấp bởi hãng Messer (Singapore).
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 36
Trứng nuôi trong môi trường nói trên và chia ra hai lô cho mỗi ựợt thắ nghiệm. Lô 01 nuôi trong tủ nuôi Sanyo-1 ở ựiều kiện 5%CO2 và 20%O2, 390C (hình 12), ựộ ẩm bão hòa trong 32 giờ. Lô 2 nuôi trong tủ nuôi Sanyo-2 ở ựiều kiện 5%CO2 và 5%O2, 390C (hình 13), ựộ ẩm bão hòa trong 32 giờ.
3.2.5. Phân tách lớp tế bào cumulus
Trứng sau nuôi thành thục 32 giờ, chuyển sang môi trường TCM199- Hepes với các ựiều kiện khác nhau về:
Nồng ựộ enzym Hyaluronidaza
Trứng dê sau nuôi thành thục ựược chuyển vào môi trường TCM199- Hepes ựã bổ sung enzym Hyaluronidaza với các nồng ựộ khác nhau (0,2mg/ml; 0,5mg/ml; 1mg/ml; 1,5mg/ml), sau thời gian 10 phút, quan sát sự phân rã của các lớp tế bào cumulus bao quanh trứng trên kắnh hiển vi soi nổi Nikon SMZ1000.
Nhiệt ựộ môi trường
Trứng dê sau nuôi thành thục ựược chuyển vào môi trường TCM199- Hepes có nồng ựộ enzym Hyaluronidaza là 0,5mg/ml và 1mg/ml, mỗi nồng ựộ sẽ ựược khảo sát tương ứng với 03 mốc nhiệt ựộ (320C, 370C, 400C).
Nhiệt ựộ môi trường ựược ựiều chỉnh chắnh xác bằng cách ựặt ựĩa NUNC chứa trứng và môi trường lên trên bàn ấm Minitub (đức), ựậy nắp kắn. Thời gian lưu trứng trong môi trường TCM199-Hepes có bổ sung enzym Hyaluronidaza thay ựổi như sau:
Thời gian xử lý (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thời gian xử lý: 30 giây, 60 giây, 90 giây, 120 giây, 180 giây
đặt trứng ựã nuôi thành thục vào môi trường TCM199-Hepes có bổ sung enzym Hyaluronidaza trong các khoảng thời gian rút ngắn (30 giây, 60 giây,
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 37
90 giây, 120 giây, 180 giây), nhiệt ựộ 370C, kết hợp dùng pipet thủy tinh có ựường kắnh trong là 130-150 ộm ựể tách sạch lớp tế bào cumulus bao quanh.
Mức ựộ tác ựộng của enzym Hyaluronidaza
Mức ựộ tác ựộng của enzym Hyaluronidaza ựược ựánh giá bằng số lớp tế bào cumulus còn lại bao quanh trứng.
3.2.6. đánh giá sự thành thục của trứng dê
Trứng sau thời gian nuôi thành thục ở các ựiều kiện nói trên ựược chuyển sang môi trường TCM199-Hepes có bổ sung enzym Hyaluronidaza (Sigma) ở nồng ựộ 1,0 mg/ml. Việc phân tách tế bào cumulus của trứng dê ựược thực hiện trên kắnh hiển vi soi nổi Nikon SMZ1000 có bàn ấm Tokai Hit (370C)(hình 6) trong 120-180 giây và có kết hợp phương pháp tách cơ học (hút lên xuống bằng pipet thủy tinh có ựường kắnh trong là 130-150 ộm).
Trứng ựược ựánh giá là thành thục khi quan sát thấy thể cực thứ nhất xuất hiện (quan sát trực tiếp hoặc nhuộm Orcein 1%)(hình 9).
3.2.7. Xử lý số liệu
Số liệu ựược sử lý thống kê sinh học trong chương trình Excel, sự khác nhau của hai giá trị phần trăm và trung bình ựược thực hiện so sánh bằng hàm
F-test và T-test.. Sự khác nhau giữa các số liệu so sánh ựược xem là có ý nghĩa thống kê khi giá trị P < 0,05.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 38
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Nghiên cứu các ựiều kiện thắch hợp ựể thu và bảo quản buồng trứng buồng trứng
Buồng trứng dê vận chuyển từ lò mổ về phòng thắ nghiệm trong vòng 2 Ờ 4 giờ. Thiết bị giữ và vận chuyển mẫu chuyên dụng do hãng Cryologic (Úc) cung cấp. Thiết bị này có nguồn ựiện ựộc lập (bình ắc qui) và có nút ựiều chỉnh nhiệt ựộ, màn hình hiển thị chắnh
xác nhiệt ựộ giữ mẫu (250C, 300C, 370C).
Trứng ựược thu bằng phương pháp hút trứng trực tiếp từ các nang, chỉ sử dụng trứng loại tốt cho các thắ nghiệm nuôi thành thục trứng sau ựó ở trong tủ nuôi Sanyo ở chế ựộ 5%CO2, 390C, kết quả chúng tôi thu ựược ựược trình bày ở bảng 1 và biểu ựồ 1.
Bảng 1: Ảnh hưởng của nhiệt ựộ bảo quản ựến tỉ lệ trứng dê thành thục
in vitro
Nhiệt ựộ bảo quản mẫu thắ nghiệm Số trứng sử dụng (n) Số trứng thành thục (n) Tỉ lệ trứng thành thục (%) 250C 87 38 43,68a 300C 94 56 59,57b 370C 86 50 58,14b (Các chữ a, b: Sai khác thống kê rõ rệt (P<0,05))
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 39
Biểu ựồ 1: Ảnh hưởng của nhiệt ựộ bảo quản ựến tỉ lệ trứng dê thành thục in vitro
Từ kết quả ở bảng 1 và biểu 1, chúng ta thấy, Tỷ lệ trứng thành thục sau nuôi cấy với các lô trứng ựược bảo quản ở nhiệt ựộ 300C và 370C cao hơn hẳn so với ở nhiệt ựộ 250C. Như
vậy, nhiệt ựộ bảo quản thắch hợp trong việc bảo quản mẫu buồng trứng dê dao ựộng trong khoảng 30-370C. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của (N.Crozet và cs, 1995), nhiệt ựộ bảo quản buồng trứng khi vận chuyển là 300C, (M.Khatun và cs, 2010), nhiệt ựộ bảo quản buồng trứng khi vận chuyển là 350C.
Thời gian bảo quản mẫu cũng là một vấn ựề ựáng lưu ý. Về nguyên tắc, thời gian bảo quản
càng ngắn càng tốt (Wang.Z.K và cs, 1995). Tuy nhiên trên thực tế, ựịa ựiểm thu mẫu xa phòng thắ nghiệm (từ vài Km ựến hơn 10Km), Thời gian mổ dê ở
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 40
các lò mổ sớm (khoảng 3 Ờ 4 giờ sáng) làm cho thời gian này không thể nhanh hơn 02 giờ. Nhìn chung, việc thu mẫu cũng tương tự giữa phòng thắ nghiệm của chúng tôi và nhiều phòng thắ nghiệm trên thế giới, quá trình thu mẫu là vất vả vì mẫu cần thu ngay khi con vật vừa bị giết ựể ựảm bảo khả năng sống của tế bào trứng bên trong.
Thông thường, có thể sử dụng hai loại dung dịch ựể vận chuyển buồng trứng. Một là, dùng dung dịch nước muối sinh lý; hai là, dùng dung dịch PBS. Cả hai dung dịch này ựều cần bổ sung kháng sinh như một yếu tố chống nhiễm khuẩn trong suốt quá trình thu và vận chuyển mẫu buồng trứng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tại phòng thắ nghiệm của chúng tôi, việc bảo quản mẫu ựược ưu tiên thực hiện trong môi trường PBS có bổ sung kháng sinh (100000UI Penicilin+0,05 gr Streptomycin) vì ựây là môi trường giàu dinh dưỡng hơn, có ảnh hưởng tốt ựến sức sống của trứng hơn. Tuy nhiên, giá thành của dung dịch này cũng cao hơn, nhất là phải chú ý lọc vô trùng môi trường ngay sau khi pha bằng cách sử dụng màng lọc vô trùng, sau ựó môi trường ựược bảo quản tủ lạnh (+40C), khi dùng phải làm ấm ựến 370C.
4.2. Nghiên cứu khả năng khai thác trứng dê từ buồng trứng
Trứng trong nang trứng ựược thu bằng một trong hai phương pháp hút trực tiếp (dùng xilanh) (hình 4) hoặc cắt lớp (dùng dao mổ và panh kẹp) (hình 5).
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 41
So sánh hiệu quả thu trứng giữa hai phương pháp hút trực tiếp và cắt lớp cho thấy số lượng trứng ựạt yêu cầu thắ nghiệm (loại A và B) là không khác nhau giữa hai phương pháp này (P>0,05). Số trứng loại A, B thu ựược trung bình là 0,42 trứng/buồng trứng. Số liệu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của (Z.G.Wang và cs, 2007), tuy nhiên lượng trứng thu ựược từ hai phương pháp trên của ông cao hơn (Từ 1,4 Ờ 3,9 trứng/buồng trứng) do ông sử dụng buồng trứng của dê Boer trong ựộ tuổi trưởng thành làm thắ nghiệm.
điều cần lưu ý khi tiến hành hai phương pháp trên là ựộng tác thu trứng phải ựược tiến hành hết sức nhẹ nhàng ựể tránh không làm hỏng trứng. Yếu tố nhiệt ựộ cũng ựược xem là một yếu tố quan trong khi thực hiện giai ựoạn này. Thông thường, chúng tôi sử dụng môi trường TCM199-Hepes ựã ựược làm ấm trước ựó ở 370C ựể thu và chọn lọc trứng.
4.3. Nghiên cứu phân loại, ựánh giá và nâng cao chất lượng trứng dê trước và sau nuôi in vitro trứng dê trước và sau nuôi in vitro
Trong nội dung này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tế bào học ựể xác ựịnh trạng thái trứng trước và sau nuôi in vitro cũng như so sánh chất lượng trứng thành thục qua ựánh giá hình thái nguyên sinh chất và thể cực.
Các trứng thu từ nang trứng ựều ở trạng thái chưa thành thục và ựược phân loại ngay trên kắnh hiển vi dựa vào hình thái lớp tế bào cumulus bao quanh(Hình 6). Ở ựây, chúng tôi chỉ quan tâm ựến trứng có chất lượng loại tốt A (tế bào cumulus bao quanh trứng là dày ựặc, ựều ựặn và liên kết chặt chẽ với nhau)(Hình 7) và trứng có chất lượng loại B (tế bào cumulus bao quanh trứng không dày ựặc và ựều ựặn)(Hình 8).
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 42
Các trứng này, sau khi nuôi thành thục, cần ựánh giá sự thay ựổi, cụ thể là sự xuất hiện hay không của thể cực thứ nhất. Nếu thể cực thứ nhất xuất hiện thì trứng ựược ựánh giá là thành thục(Hình 9).
Tuy nhiên, một khó khăn gặp phải khi quan sát thể cực là do lớp tế bào cumulus bao phủ quanh trứng. Chúng làm ta không thể quan sát trực tiếp thể cực. điều này ựặt ra vấn ựề là phải tách sạch lớp tế bào cumulus nói trên. Việc tách sạch lớp tế bào cumulus sẽ phải diễn ra ngoài tủ nuôi nên thời gian tiến hành càng dài sẽ càng ảnh hưởng tới chất lượng trứng sau này, vì vậy cần phải tìm cách rút ngắn thời gian này lại.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 43
Ý nghĩa tiếp theo của việc phân tách lớp tế bào cumulus là nhằm bước ựầu xây dựng các kỹ thuật nền của việc tạo phôi bằng phương pháp vi tiêm tinh trùng vào bào tương của trứng cũng như công nghệ tạo phôi nhân bản.
Do vậy, chúng tôi ựã bố trắ một thắ nghiệm sử dụng enzym Hyaluronidaza ựể phân tách lớp tế bào cumulus bao quanh trứng dê. Chúng tôi tập trung nghiên cứu ảnh hưởng của enzym Hyaluronidaza ựến khả năng phân tách lớp tế bào cumulus ở các ựiều kiện khác nhau (nồng ựộ enzym sử dụng, nhiệt ựộ môi trường ủ enzym và trứng, thời gian xử lý).
để có thể bắt ựầu thực hiện ựược các kỹ thuật vừa ựề cập, cần phải có nguồn trứng dê có chất lượng tốt và ựược nuôi thành thục in vitro (Guo và cs, 2002). Sau ựó các trứng này ựược tách sạch lớp tế bào cumulus xung quanh bằng cách sử dụng enzym Hyaluronidaza (Lan và cs, 2006),( Garcắa-Roselló E, 2009).
Mục ựắch của nghiên cứu này là xác ựịnh ựược phương pháp thắch hợp trong việc phân tách lớp tế bào cumulus của trứng dê thông qua việc sử dụng enzym Hyaluronidaza.
4.3.1. Ảnh hưởng của nồng ựộ enzym Hyaluronidaza
Enzym Hyaluronidaza mà chúng tôi sử dụng trong các nghiên cứu dưới ựây có nguồn gốc từ tinh hoàn của bò (Type I-S), ựây là sản phẩm thương mại hóa của Sigma-Aldrich mà nhiều phòng thắ nghiệm sử dụng trong quá trình phân tách lớp tế bào cumulus (Izquierdo và cs, 2002); (Lan và cs, 2006); (Garcắa-Roselló và cs, 2009); (M.Khatun và cs, 2010).
Mức ựộ tác ựộng gây phân rã lớp tế bào cumulus của enzym Hyaluronidaza trong thắ nghiệm của chúng tôi ựược trình bày ở bảng 2 và biểu ựồ 2. Thời gian tiến hành cho enzym tác ựộng là 10 phút (Garcắa-Roselló E, 2009), thắ nghiệm diễn ra ở ựiều kiện nhiệt ựộ phòng (250C Ờ 280C).
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 44
Bảng 2 : Mức ựộ phân rã của lớp tế bào cumulus trong môi trường TCM199-Hepes có nồng ựộ enzym Hyaluronidaza khác nhau
Mức ựộ phân rã của lớp tế bào cumulus trong TCM199-Hepes có nồng ựộ enzym Hyaluronidaza
(mg/ml) tương ứng Lô thắ nghiệm Số trứng (n) 0,2 0,5 1,0 1,5 1 25 + ++ ++ +++ 2 37 - + ++ ++ 3 42 - + + ++ 4 38 + ++ +++ +++ 5 51 - + ++ ++ 6 20 - + ++ ++ Tổng số 213 Ghi chú: (+): còn 70-90; (++): còn 30-70%; (+++): còn 10-30% lớp tế bào cumulus; (-): các lớp tế bào cumulus hầu như không thay ựổi.
Biểu ựồ 2. Mức ựộ phân rã trung bình của lớp tế bào cumulus trong môi trường TCM199-Hepes có nồng ựộ enzym Hyaluronidaza khác nhau
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 45
Qua kết quả trình bày ở bảng 2 và biểu ựồ 2, chúng ta có thể nhận xét là enzym Hyaluronidaza bắt ựầu phát huy hoạt tắnh phân giải liên kết giữa các tế bào cumulus bao quanh trứng ở nồng ựộ bắt ựầu từ 0,5mg/ml. Nồng ựộ enzym Hyaluronidaza là 1,0mg/ml cho kết quả rõ rệt hơn, tỷ lệ trứng còn từ 30 Ờ 70% lớp tế bào cumulus chiếm ựa số trong các lô thắ nghiệm. Với nồng ựộ enzym ựậm ựặc hơn (1,5 mg/ml), kết quả này cũng không rõ rệt hơn nhiều