Trên thế giới, việc nghiên cứu nuôi thành thục trứng non trong ống nghiệm (IVM) trên dê cũng ựã có nhiều nghiên cứu và cho nhiều kết quả khả quan ở nhiều quốc gia khác nhau trong nhiều năm gần ựây. Thường thì việc nghiên cứu nuôi thành thục trứng non trong ống nghiệm (In vitro maturation Ờ IVM) hay kết hợp với các nghiên cứu khác như: Thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro fertilization Ờ IVF) và nuôi cấy phôi (In vitro culture Ờ IVC) tạo thành bộ 3 hoàn chỉnh trong quy trình công nghệ phôi hiện ựại (Y.Congnie và cs, 2003), các kết quả ựó cũng ựã ựược công bố trên nhiều tạp chắ lớn trên thế giới như Jorurnal of animal science, Biology of reproduction, ELSEVIERẦ
A.I.Younis, K.A.Zuelke, K.M.Harper, M.A.I.Oliveira và B.G.Brackett ựã nghiên cứu ựề tài ỘThụ tinh trứng dê trong ống nghiệmỢ (In vitro
Fertilization of Goat Oocytes) và ựã công bố trong tạp chắ Biology of reproduction năm 1991: 23 dê các giống ựược chuẩn bị tiêm kắch tố phát triển buồng trứng (FSH, PGF2α, LutalyseẦ) sau ựó ựược mổ ra ựể thu buồng trứng lấy nang. Các nang trứng sau khi thu ựược phân loại rồi ựem nuôi cấy với môi trường TCM199 có bổ sung các hormon khác nhau vào. Kết quả cho thấy môi trường bổ sung thêm LH hoặc/ và FSH nuôi cấy cho kết quả tốt hơn hẳn việc không bổ sung.
Năm 1995, N.Crozet, M.Ahmed-Ali và M.P.Dubos nghiên cứu công trình Ộkhả năng phát triển của trứng dê qua các giai ựoạn IVM, IVF, IVC thu ựược từ các loại nang trứng có kắch cỡ khác nhauỢ (Developmental competence of goat oocytes from follicle of different size categories
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 25
following maturation, fertilization and culture in vitro) tại Pháp và ựã ựược công bố trong tạp chắ Journal of Reproduction and Fertility. Kết quả cho thấy: Số lượng phức hợp tế bào trứng Ờ tế bào cumulus (Cumulus oocyte complexes Ờ COCs) có thể chọn ựem nuôi (IVM) ở các buồng trứng cỡ lớn (>5 mm) và cỡ vừa (3,1 Ờ 5 mm) là cao nhất, chiếm 87% và 84% tổng số nang trứng hoàn thiện. Thấp nhất là ở những nang trứng cỡ nhỏ (2 Ờ 3 mm), chiếm 62% tổng số nang trứng hoàn thiện. Số nang trứng ựược chọn ựem nuôi (IVM) chuyển sang giai ựoạn Metaphase II (MII) thành công ở các buồng trứng có kắch cỡ khác nhau cũng khác nhau. Buồng trứng có kắch cỡ to (>5 mm) cho kết quả tốt nhất (97%), sau ựó là cỡ vừa (3,1 Ờ 5 mm): chiếm 83% và thấp nhất là cỡ nhỏ (2 Ờ 3 mm): chiếm 70% và khi ựem thụ tinh cũng như nuôi cấy phôi thì kết quả cũng tương tự, tỷ lệ thành công ở trứng thu từ buồng trứng lớn cao hơn từ buồng trứng nhỏ.
E. Amoah và S. Gelaye ựã công bố công trình nghiên cứu Ộ Những tiến bộ khoa học công nghệ trong việc nhân bản dê (Biotechnological Advances in Goat reproduction) trong tạp chắ khoa học ựộng vật (Journal of animal science) năm 1997. Ông ựã nghiên cứu nuôi cấy trứng dê qua việc ựi lấy mẫu buồng trứng dê ở lò mổ và ông cho rằng thu trứng bằng phương pháp cắt lát buồng trứng với chọc hút buồng trứng ựều cho kết quả tương tự nhau bởi dê ở lò mổ ựa phần là dê chưa ựến tuổi thành thục về tắnh. Ông cũng thấy rằng số nang trứng thu ựược ở những buồng trứng có kắch thước to (>5 mm) cho kết quả sau nuôi thành thục (IVM) tốt hơn nhiều so với số nang trứng thu ựược ở những buồng trứng nhỏ (<5 mm). Trong quá trình nuôi cấy, ông cũng nhận thấy rằng việc bổ sung các glycoprotein hormon (LH, FSH, HCG, TSH) vào môi trường nuôi TCM199 cho kết quả tốt hơn nhiều so với không cho chúng vào.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 26
Từ những năm 2000 trở ựi, các công trình nghiên cứu nuôi thành thục trứng dê trong ống nghiệm trên thế giới ựược công bố ngày càng nhiều, năm 2002, P. Tajika, N.Shams Esfandabadid nghiên cứu ựề tài Ộnuôi thành thục trứng dê cừu trong ống nghiệm ở các môi trường nuôi khác nhauỢ. Các ông ựã thử nghiệm nuôi thành thục trứng non bằng môi trường TCM199 có bổ sung Penicillin và Streptomycin và một trong các loại huyết thanh khác nhau: huyết thanh bê (FBS), huyết thanh cừu (ESS), huyết thanh dê (EGS). Sau khi nuôi trong một khoảng thời gian là 24 Ờ 26 tiếng ựem kiểm tra thấy việc bổ sung huyết thanh vào môi trường nuôi cấy là rất cần thiết và việc bổ sung huyết thanh nào vào môi trường nuôi trứng cũng ựều rất tốt, không có sự khác biệt rõ ràng với các loại huyết thanh khác nhau.
Năm 2003, Y.Cognié và cs nghiên cứu ựề tài Ộhiện trạng công nghệ phôi trên dê cừuỢ và ựược ựăng trên tạp chắ ELSEVIER. Ông làm thắ nghiệm giữa việc dùng hay không dùng Cysteamine vào môi trường nuôi TCM199 có bổ sung 10% FF, 100 ng/ml FSH. Ông nhận thấy rằng việc bổ sung Cysteamine vào môi trường nuôi cấy làm tăng hiệu quả nuôi thành thục trứng sang giai ựoạn MII rất rõ ràng. E.González và cs nghiên cứu ựề tài năm 2012 Ộkhả năng phát triển của trứng dê non ựược chọn lựa bằng BCB (Brilliant Cresyl Blue) và nuôi với môi trường có bổ sung systeamineỢ. Tác giả ựưa ra kết luận: Trong môi trường có thêm BCB và systeamine ựể nuôi trứng dê thì trứng dê non phát triển tốt hơn môi trường bình thường. Yohan Rusiyantono và cs thuộc khoa Chăn nuôi Thú y, khoa Nông nghiệp Ờ Trường đại học Tadulako Ờ Indonesia ựã công bố kết quả công trình nghiên cứu Ộsự ảnh hưởng của môi trường CR1aa trong nuôi thành thục, thụ tinh ống nghiệm và những phát triển bước ựầu của trứng dê trong phòng thắ nghiệmỢ (Yohan. R và cs, 2003). Ông ựã ựưa ra thắ nghiệm so sánh việc nuôi thành thục trứng non bằng hai loại môi trường là TCM199 và CR1aa. Sau khi nuôi, kết quả không
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 27
có sự khác biệt nhiều giữa hai môi trường này. Tuy nhiên sự phát triển về sau này của phôi (giai ựoạn thụ tinh và nuôi phôi) thì những trứng nuôi ở môi trường CR1aa cho khả năng thành công cao hơn.
Năm 2004, Herrick và cs công bố kết quả nghiên cứu ựề tài trên tạp chắ
PUBMED ỘSự ảnh hưởng của việc bổ sung các ựại phân tử trong suốt quá trình nuôi thành thục trứng dê non tới tiềm năng phát triểnỢ. Ông ựã ựưa ra 3 thắ nghiệm nuôi thành thục trứng bằng môi trường TCM199. Thắ nghiệm 1: Bổ sung thêm 10% huyết thanh dê hoặc dịch ống dẫn trứng nhân tạo (mSOFmat) với 2,5; 8, hoặc 20 mg/ml huyết thanh bê (BSA). Thắ nghiệm 2: Bổ sung mSOFmat với 4; 8; 12 hoặc 16 mg/ml BSA. Thắ nghiệm 3: Bổ sung 1 mg/ml Polyvinyl alcohol (PVA; coltrol), 4 mg/ml BSA, 0,5 mg/ml Hyaluronate với 0,5 mM citrate. Nuôi trứng trong cùng ựiều kiện nhiệt ựộ, thời gianẦ và ông thu ựược kết quả: Ở thắ nghiệm 1, lượng BSA bổ sung bằng 2,5 hoặc 8 mg/ml vào dung dịch cho kết quả tốt hơn bổ sung 20 mg/ml. Với 2 thắ nghiệm sau ựều cho kết quả tương tự như nhau.
Năm 2006. S.D.Kharche và cs công bố kết quả trên tạp chắ ELSEVIER ựề tài Ộnuôi thành thục trứng non dê cừu trong các nồng ựộ huyết thanh dê khác nhauỢ. Ông chọn lựa và thu hoạch trứng dê từ lò mổ, chọn những trứng ựạt tiêu chuẩn loại 1 (COCs) và chia thành 4 nhóm. Nhóm 1 (n=105)(ựối chứng), nuôi trong môi trường TCM199 không bổ sung huyết thanh. Nhóm 2,3,4 (n>100), trứng ựược rửa 5 lần rồi nuôi trong môi trường TCM199 có bổ sung huyết thanh dê (EGS) với các nồng ựộ: 10%, 15%, 20%. Sau 24 Ờ 27 tiếng nuôi, trứng ựược bổ sung thêm 0,1% Hyaluronidaza và ựem cố ựịnh, nhuộm orcein. Kết quả cho thấy có sự khác biệt lớn giữa lô ựối chứng và lô thắ nghiệm. Các lô thắ nghiệm cho tỷ lệ nuôi trứng thành công cao hơn lô ựối chứng từ 61 Ờ 78%. Lô 2 và 3 không có sự khác biệt lớn nhưng lô 3 thì cho
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 28
kết quả nuôi thành công hơn rõ rệt. Như vậy việc bổ sung EGS vào môi trường là rất cần thiết và nồng ựộ khuyến cáo bổ sung là 20%.
Năm 2007, Z. G. Wang và cs Ờ Trường đại học Zhejiang, Hang Zhou, Trung Quốc công bố kết quả nghiên cứu Ộảnh hưởng của phương pháp thu trứng và phương tiện nuôi trong nuôi thành thục trứng non và sự phát triển về sau của trứng dê boerỢ trên tạp chắ khoa học ựộng vật (Journal Animal Science). Ông làm thắ nghiệm với các cách lấy trứng khác nhau (cắt lát, chọc, hút cách I và hút cách II) (thắ nghiệm 1). Trứng thu ựược ựược ựếm tổng số và phân loại ra. Trứng loại 1 ựược ựem nuôi cấy trong các môi trường (TCM199 + 1UI/ml FSH), (TCM199 + 10 ng/ml EGF), (TCM199 + 10 ng/ml EGF + 1UI/ml FSH), (TCM199 + 10% FCS), (TCM199 + 10% FCS + 1UI/ml FSH). Kết quả cho thấy phương pháp cắt lát và chọc cho kết quả cao hơn hẳn (6,3 và 5,8 trứng/buồng trứng) so với hai phương pháp chọc hút (2,9 và 3,1 trứng/ buồng trứng). Môi trường có mặt FSH cho kết quả nuôi trứng tốt hơn những môi trường còn lại.
Năm 2010. M.Khatun và cs thuộc trường đại học Nông nghiệp Bangladesh công bố công trình nghiên cứu trên tạp chắ khoa học công nghệ thú y (journal of veterinary science) Ộnuôi thành thục trứng non và thụ tinh ống nghiệm trứng dê Bengal ựen hậu bị và trưởng thànhỢ. Các tác giả ựã thu lượm 31 buồng trứng dê nhỏ và 61 buồng trứng dê Bengal ựen lớn từ lò mổ. Sau khi phân tắch, thu lượm trứng và nuôi cấy, kết quả cho thấy tỷ lệ số trứng chuyển sang MII của dê trưởng thành cao hơn của dê non (66,3% và 60,3%, P<0,05).
M.T.Paramio công bố công trình ỘNhững sản phẩm mô phôi dê nuôi trong phòng thắ nghiệm và bản ựộng vậtỢ ựược ựăng trên tạp chắ ELSEVIER. Tác giả cũng ựã nghiên cứu cho ra một quy trình chuẩn ựể nuôi trưởng thành trứng trong ống nghiệm và ông cũng kết luận rằng trứng thu ựược từ dê
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 29
trưởng thành và dê chưa trưởng thành cho kết quả nuôi thành thục và thụ tinh trong ống nghiệm tương ựương nhau, tuy nhiên ở giai ựoạn phát triển phôi (blastocyst) có sự khác biệt rõ ràng về sự phát triển giữa nhóm trứng của dê non và dê trưởng thành (12% - 36%).
Elena Sogorescu và cs thuộc khoa Khoa học tự nhiên và Nông nghiệp Ờ trường đại học Ovidius, Constanta Ờ Romania ựã nghiên cứu ựề tài ỘSự ảnh hưởng của phương pháp mới ựến khả năng phát triển của trứng dê cừuỢ. Tác giả ựưa ra 7 môi trường nuôi trứng dê khác nhau, trứng dê ựược nuôi trong các môi trường có cùng thời gian, ựiều kiện nuôi và thời gian thu hoạch giống nhau.
1. Dung dịch TCM 199 (1,5g/250 dl stock solution) với 50 ng/ml FSH, 10 ng/ml LH, 100 ộl Oestradiol, 10% nước dưa chuột.
2. Dung dịch TCM 199 (1,5g/250 dl stock solution) với 50 ng/ml FSH, 10 ng/ml LH, 100 ộl Oestradiol, 10% nước cà rốt.
3. Dung dịch TCM 199 (1,5g/250 dl stock solution) với 50 ng/ml FSH, 20 ng/ml EGF, 10% nước cà rốt.
4. Dung dịch TCM 199 (1,5g/250 dl stock solution) với 50 ng/ml FSH, 20 ng/ml EGF, 10% nước dưa chuột.
5. Dung dịch HankỖs (50ml/500dl stock solution) với 40 ng/ml insulin, 20 ng/ml FSH và 10% nước cà rốt.
6. Dung dịch Dulbecco (2,5 g/250dl stock solution) với 100 ộl Cysteamine, 10% nước cà rốt.
7. Dung dịch PBS với 100 ộl Cysteamine, 20 ng/ml EGF và 50 ng/ml FSH. Kết quả cho thấy; sau 17 giờ nuôi, 24 giờ ủ, trứng nuôi ở dung dịch 7 cho kết quả tốt nhất.
Với thế mạnh về chọn tạo các giống ựộng vật có phẩm giống tốt, có khả năng ựóng góp cho ngành công nghiệp dược phẩm (pharmaceutical products)
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 30
và Y-Sinh học (bio-medical products), công nghệ sinh học sinh sản ựược nghiên cứu và ứng dụng phục vụ cho các mục ựắch cải tạo giống, hỗ trợ sinh sản ở vật nuôi (Lunovic và cs, 2000) và cho cả các nghiên cứu về tế bào gốc ở người (Liu và cs, 2009).