Phương pháp nuôi trứng in vitro
Cơ sở của các phương pháp nuôi thành thục trứng các loài ựộng vật bậc cao trong ống nghiệm là việc hiểu biết và vận dụng tốt quá trình thành thục trứng trong tự nhiên của chúng.
Các trứng thu ựược bằng phương pháp in vitro hay in vivo
ựã trình bày ở trên ựược ựưa vào nuôi thành thục. Do có sự liên quan chặt chẽ giữa chất lượng trứng và hình thái bên ngoài, người ta chọn những trứng có chất lượng tốt ựể ựưa vào nuôi trong môi trường giàu chất dinh dưỡng với
sự có mặt của những tế bào granulose (nồng ựộ 1-5 triệu tế bào/ml). Nhiệt ựộ tủ nuôi = 390C, nồng ựộ khắ CO2 = 5% (Donnay và cs, 1997), (Gali và cs, 2001).
Môi trường nuôi ựược bổ sung huyết thanh dê ựang ựộng dục (giàu LH, FSH, Oestradiol) hoặc bằng huyết thanh bào thai dê (FCS) (giàu IGF-1) và bổ sung thêm Oestradiol 17β. Tuy nhiên ựể hoàn thiện quá trình thụ tinh trong ống nghiệm thì vẫn phải bổ sung thêm LH và FSH vào môi trường nuôi trứng (Pieterse và cs, 1988); (Mizushima và cs, 2000); (Paloma Duque và cs, 2003).
Hiện nay môi trường cơ bản dùng ựể nuôi thành thục trứng trong hầu hết các phòng thắ nghiệm là môi trường TCM199 có bổ sung thêm LH, FSH, Oestradiol, huyết thanh ựộng vật mang thai, pyruvate NaẦViệc bổ sung các chất trên là rất cần thiết nhằm ựảm bảo sự phát triển bình thường và ựầy ựủ của trứng, nhân trứng, bào tương và lớp tế bào trong suốt ựến giai ựoạn thành thục.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 23
để ựánh giá ựược sự thành thục của trứng nuôi trong ống nghiệm cần phải ựem nhuộm nhân hoặc nhiễm sắc thể của trứng. Như vậy những trứng ựem xác ựịnh sẽ không thể tiếp tục ựem làm các công ựoạn tiếp theo như thụ tinh ống nghiệm hay cấy chuyển nhân (nuclear transfer). để ựỡ mất ựi những quả trứng quý giá ựó, chúng ta có thể dùng biện pháp ựánh giá sự thành thục của trứng thông qua việc quan sát những dấu hiệu bên ngoài sau một thời gian nuôi trong ống
nghiệm. đó chắnh là các căn cứ dựa trên sự bông tơi của các tế bào cumulus bao quanh trứng hoặc sự xuất hiện của thể cực thứ nhất (Leibfried và cs, 1979).
Thông thường ựể ựánh giá sự thành thục của nhân trứng, người ta tiến hành nhuộm nhân của lô trứng ựối chứng bằng thuốc nhuộm Orcein 1%. Kết quả thu ựược ựược dùng như một thông số tham khảo cho các lô trứng cùng nguồn gốc, cùng chất lượng ban ựầu hoặc cùng phương pháp và ựiều kiện nuôi thành thục. Việc ựánh giá sự thành thục của nguyên sinh chất là rất khó.
Hiện nay, khi các kỹ thuật nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm, thụ tinh trong ống nghiệm và nuôi phôi trong ống nghiệm ựã trở thành một tổ hợp công nghệ sinh học hoàn chỉnh thì việc ựánh giá kết quả của giai ựoạn nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm thường ựược phản ánh qua kết quả thụ
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 24
tinh ống nghiệm (số phôi dâu, số phôi nang) thu ựược về sau này (Paloma Duque và cs, 2003).