Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 35
Phương pháp nuôi thành thục trứng trong nghiên cứu này dựa vào phương pháp của (Izquierdo và cs, 2002) có cải tiến.
Trứng sau khi ựược rửa qua 04 ựĩa NUNC có chứa môi trường TCM199-Hepes, chúng ựược chuyển vào giọt nuôi (50ộl) có chứa môi trường TCM199 ựã bổ sung 0,25mM Natri Pyruvate, 10% (v/v) Fetal Bovine Serum (FBS), 0,05ộg/ml Follicle Stimulating Hormon (FSH), 05ộg/ml Luteinizing Hormon (LH), 01 ộg/ml Oestradiol.
Các giọt nuôi trứng nói trên ựược phủ dầu khoáng (Sigma-M8410) và cân bằng trong tủ nuôi có ựiều chỉnh 390C, 5% CO2(hình 12), khắ bão hòa hơi nước trước khi dùng từ 1-2 giờ.
Thời gian nuôi trứng trong ựiều kiện tủ nuôi như trên kéo dài 32 giờ. Sau ựó, trứng ựược lấy ra khỏi môi trường nuôi và chuyển vào môi trường TCM199-Hepes ựể tiến hành các thao tác tách tế bào cumulus tiếp theo.
Phương pháp nuôi 02
Phương pháp nuôi thành thục trứng ựược cải tiến dựa trên phương pháp của (M.Khatun và cs, 2010).
Trứng dê (2 Ờ 5 trứng) ựược nuôi in vitro trong 50 ộl môi trường TCM199 (TCM199, EarleỖs salt with L-Glutamine and NaHCO3, Sigma, USA) có bổ sung LH (05 ộg/ml), Oestradiol (01 ộg/ml), Gentamycin (50 ộg/ml), FBS (10% v/v), Natri Pyruvate (0,25mM) và FSH với các nồng ựộ khác nhau (0,05; 0,1; 0,2 ộg/ml).
Các giọt môi trường ựược phủ dầu khoáng và chứa trong ựĩa NUNC 35mm. Toàn bộ ựĩa nuôi có chứa môi trường ựược cân bằng ắt nhất 02 giờ trong tủ nuôi Sanyo (Nhật Bản) ở ựiều kiện 5%CO2, 390C, ựộ ẩm bão hòa. Khắ hóa lỏng CO2 và N2 sử dụng cho các thắ nghiệm ựược cung cấp bởi hãng Messer (Singapore).
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 36
Trứng nuôi trong môi trường nói trên và chia ra hai lô cho mỗi ựợt thắ nghiệm. Lô 01 nuôi trong tủ nuôi Sanyo-1 ở ựiều kiện 5%CO2 và 20%O2, 390C (hình 12), ựộ ẩm bão hòa trong 32 giờ. Lô 2 nuôi trong tủ nuôi Sanyo-2 ở ựiều kiện 5%CO2 và 5%O2, 390C (hình 13), ựộ ẩm bão hòa trong 32 giờ.