a, b, c (P < 0,001)
3.4.6 So sánh hiệu quả sản xuất phôi thụ tinh ống nghiệ mở bò vàng và bò lai Sind
và bò lai Sind
Dùng tinh trùng đông lạnh-giải đông của đực giống A-5 thụ tinh trong ống nghiệm với các trứng có chất l−ợng tốt của hai giống bò Vàng và bò lai Sind với số l−ợng lần l−ợt là 207 và 210 trứng.
Nuôi phôi trong môi tr−ờng B2 có bổ sung tế bào Vero. Nhiệt độ tủ nuôi là 39oC, thành phần khí 5%CO2, 5%O2, 90%N2. Đánh giá sự phát triển của phôi ở các giai đoạn 2-4 tế bào, phôi dâu và phôi nang. Kết quả đ−ợc trình bày ở bảng 3.30.
Bảng 3.30: So sánh hiệu quả sản xuất phôi ống nghiệm từ trứng bò vàng và bò lai Sind. Số trứng (n) Phân chia (%) Phôi dâu (%) Phôi nang (%) Bò vàng 207 70,05 a (145/207) 38,65 b (80/207) 24,64 c (51/207) Bò lai Sind 210 72,38 a (152/210) 40,00 b (84/210) 27,62 c (58/210) Kết quả sản xuất phôi ống nghiệm cho thấy tỉ lệ phôi phân chia, phát triển đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang ở hai giống bò vàng và bò lai Sind là không khác nhau có ý nghĩa thống kê ở từng giai đoạn. Các tỉ lệ này ở bò vàng lần l−ợt là 70,05%; 38,65% và 24,64% trong khi đó ở bò lai Sind lần l−ợt là 72,38%; 40,00% và 27,62%.
Quá trình thụ tinh ống nghiệm giữa tinh trùng và trứng, sự phát triển của phôi ống nghiệm lần l−ợt qua các giai đoạn 2, 4, 8 tế bào, phôi dâu, phôi nang ... đ−ợc ghi nhận qua các hình sau:
Hình 3.22: Quá trình thụ tinh ống nghiệm giữa trứng bò nuôi thành thục in- vitro và tinh trùng đông lạnh-giải đông
Hình 3.24: Phôi bò thụ tinh ống nghiệm ở giai đoạn 4 tế bào
Hình 3.25: Phôi bò thụ tinh ống nghiệm ở giai đoạn 8 tế bào
Hình 3.26: Phôi bò thụ tinh ống nghiệm ở giai đoạn phôi dâu
Hình 3.28: Phôi bò thụ tinh ống nghiệm ở giai đoạn phôi nang căng phồng
Hình 3.29: Phôi bò thụ tinh ống nghiệm ở giai đoạn phôi nang bắt đầu thoát khỏi màng sáng
Hình 3.30: Phôi bò thụ tinh ống nghiệm ở giai đoạn phôi nang đã thoát 1/2 khỏi màng sáng
Hình 3.31: Phôi bò thụ tinh ống nghiệm ở giai đoạn phôi nang đã thoát hoàn toàn khỏi màng sáng
Bê thụ tinh ống nghiệm đầu tiên ra đời 1981 tại Mỹ (Brackett và cs, 1982)[38]. Đây là một bê đực có nguồn gốc từ một trứng đã thành thục in vivo đ−ợc thụ tinh in vitro với các tinh trùng t−ơi (đã xuất ra ngoài), hợp tử đ−ợc cấy ngay vào vòi trứng của bò nhận. Sự ra đời của con bê này đánh dấu khả năng thành công đến cùng của kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm trên bò.
Năm 1987, đôi bê thụ tinh ống nghiệm đầu tiên của thế giới ra đời từ một chuỗi liên hoàn các công nghệ in-vitro trong phòng thí nghiệm (nuôi trứng thành thục trong ống nghiệm (IVM), thụ tinh ống nghiệm (IVF), nuôi phôi trong ống nghiệm (IVC), kết quả này đ−ợc công bố tại Ireland (Lu và cs, 1987[118]; 1988[117]).
Nhiều tác giả đã thu đ−ợc hiệu quả rõ rệt khi bổ sung các loại tế bào MDBK (Madin Darby Bovine Kidney), BRL (Buffalo Rat Liver), Vero hoặc các loại tế bào ống dẫn trứng, tế bào cumulus, tế bào granulose... vào môi tr−ờng nuôi hợp tử và sau đó là phôi. Việc nuôi phôi đồng thời trong môi tr−ờng có tế bào nh− vậy (co-culture) đã làm tăng 10-30% số phôi nang thu đ−ợc (Eyestone và cs, 1989[60]; Fukuda và cs, 1990[68]; Richard và cs, 1993[154]; Ferry và cs, 1994[64]; Myers và cs, 1994[127]; Guyader- Joly và cs, 1996[82]; Lonergan và cs, 1999[114]; Beker và cs, 2002[31]).
Với cùng một loại tế bào bổ sung, hiệu quả sản xuất phôi ống nghiệm ở mỗi môi tr−ờng khác nhau cũng khác nhau.
Nghiên cứu của Farin và cs (1995)[63] khi nuôi phôi bò trong môi tr−ờng 199 và B2 trong sự cùng có mặt của tế bào BRL chứng minh cho điều trên. Kết quả thu nhận của các tác giả trên cho thấy tỉ lệ phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang trong môi tr−ờng B2 (47%) là cao hơn rất nhiều khi nuôi trong môi tr−ờng 199 (33%) (P<0,001).
Kết quả nuôi phôi ống nghiệm của chúng tôi cũng chứng tỏ rằng khi bổ sung tế bào vào môi tr−ờng nuôi đã cải thiện rõ rệt hiệu quả phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang (bảng 3.22, 3.23, 3.24 và 3.25). Điều quan trọng là chúng tôi đã xác định đ−ợc môi tr−ờng B2 có bổ sung tế bào Vero là môi tr−ờng tối −u với tỉ lệ phôi nang đạt đ−ợc khoảng 23,51-24,64%. Đây chính là môi tr−ờng cho phép thu nhận đ−ợc tỉ lệ phôi nang cao nhất (hình 3.32). Đây cũng chính là môi tr−ờng mà chúng tôi đã dùng để nuôi các phôi ống nghiệm, cấy chúng để đ−ợc các bê thụ tinh ống nghiệm đầu tiên.
Các nghiên cứu của chúng tôi và các tác giả khác cũng thống nhất về hiệu quả thụ tinh ống nghiệm phụ thuộc vào chất l−ợng trứng. Đối với trứng loại A, tỉ lệ phôi nang bao giờ cũng cao hơn loại B và C. Trong nghiên cứu của Shiyoa và cs (1988)[166], kết quả phôi phân chia ở lô trứng loại A là 63,7%, cao hơn nhiều so với lô trứng có chất l−ợng B (29,5%) và lô trứng có chất l−ợng C là thấp (17,7%).
Khi tiến hành thụ tinh ống nghiệm trứng bò vàng có chất l−ợng A, B và C; chúng tôi cũng nhận thấy kết quả này cao nhất ở lô trứng có chất l−ợng A (tỉ lệ phôi phân chia là 71,43% và phôi nang là 24,14%), thấp hơn ở lô B (27,78% và 1,85%) (bảng 3.26).
Hình 3.32: So sánh tỉ lệ phôi nang trong các môi tr−ờng nuôi phôi khác nhau
2.33 8.93 8.93 2.94 9.63 3.94 11.76 4.27 23.51 0 5 10 15 20 25 199 199+ cumu lus SOF SOF +oviduct KS OM KSOM +ov iduct B2 B2+ vero % Tỉ lệ phôi nang
Kết quả thụ tinh ống nghiệm trên bò (đánh giá ở giai đoạn phân chia 2-4 tế bào) th−ờng dao dộng trong khoảng từ 30-85% tùy theo ph−ơng pháp tiến hành, đồng thời các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng kết quả thụ tinh ống nghiệm cũng rất dao động khi tiến hành thụ tinh ống nghiệm bằng các tinh trùng của các đực giống khác nhau cũng nh− trên từng đực giống, kết quả cũng thay đổi tùy vào lần lấy tinh (Ward và cs, 1984)[175]. Nh− vậy yếu tố cá thể con đực là một yếu tố cũng rất ảnh h−ởng đến việc sản xuất phôi ống nghiệm. Kết quả nghiên cứu của Hasler và cs, (1995)[87] đ−ợc trình bày trong bảng sau cho thấy rõ điều này:
Đực Tỉ lệ phân chia (%) Tỉ lệ phôi nang (%)
A 83 39 B 79 40 C 73 34 D 72 38 E 37 15 F 46 22
Kết quả thụ tinh ống nghiệm của chúng tôi cũng phù hợp với nhận định trên. Khi tiến hành thụ tinh ống nghiệm trứng bò loại A bằng tinh trùng đông lạnh-giải đông của các đực giống có ký hiệu A6, A-8 và A5, mặc dù tinh trùng đ−a vào thụ tinh là đạt tiêu chuẩn nh− nhau nh−ng kết quả thụ tinh ống nghiệm phản ảnh qua tỉ lệ phân chia và tỉ lệ phôi nang hoàn toàn không giống nhau (bảng 3.27). Tỉ lệ phôi nang đạt cao nhất ở lô thụ tinh ống nghiệm bằng tinh trùng của đực giống A-5 (24,38%) trong khi chỉ đạt trung bình và thấp ở đực giống A-6 và A-8. Việc chọn ra đ−ợc dòng tinh có hiệu quả thụ tinh ống nghiệm ổn định và kết quả cao là cần thiết trong quá trình hoàn thiện kỹ thuật cũng nh− ứng dụng sản xuất sau này.
Khi nuôi phôi với thể tích môi tr−ờng hợp lý (5-10àl cho một phôi) thì tỉ lệ phôi nang cũng cao hơn rõ rệt so với 1àl cho một phôi (bảng 3.28). Điều này có nguồn gốc từ việc giảm dần các chất nuôi d−ỡng phôi khi thời gian nuôi in vitro là kéo dài (7 ngày).
Thành phần khí nuôi cũng là một yếu tố có ảnh h−ởng đến hiệu quả sản xuất phôi ống nghiệm. Trong một nghiên cứu của Liu và Foote (1995)[111], các tác giả thu đ−ợc kết quả tỉ lệ phôi nang ống nghiệm đạt đ−ợc cao hơn (33-39%) ở lô thí nghiệm với thành phần khí O2 là 5%, trong khi đó, ở lô có nồng độ khí O2 là 20% thì kết quả này chỉ đạt từ 13-21%.
Kết quả nuôi phôi của chúng tôi (bảng 3.29) trong điều kiện thấp O2 cũng t−ơng tự các tác giả khác. So sánh hiệu quả thu đ−ợc phôi nang thì trong môi tr−ờng có thành phần khí 5%CO2, 5%O2, 90%N2; tỉ lệ phôi nang (22,73%) là cao rất rõ rệt so với trong môi tr−ờng 5%CO2 (13,49%).
Ngoài ảnh h−ởng của nồng độ khí O2 nh− trình bày ở trên thì nồng độ khí CO2 cũng là một yếu tố ảnh h−ởng đến hiệu quả thụ tinh ống nghiệm. Nghiên cứu của Merton và cs (1995)[123] chứng minh cho điều này. Kết quả ở lô nuôi phôi với nồng độ CO2 là 3% cho kết quả tốt hơn rõ rệt so với lô nuôi trong 5%CO2 (P<0,001). Cụ thể ở lô 3%CO2, tỉ lệ phôi nang thu đ−ợc ở ngày thứ bảy là 24%, trong khi đó, ở lô nuôi 5%CO2, kết quả là 18%.
Hiện nay, hai thành phần khí dùng chủ yếu trong nuôi phôi bò ống nghiệm đ−ợc sử dụng phổ biến ở các phòng thí nghiệm trên thế giới, loại thứ nhất là 5%CO2 (Papis và cs, 1995[144]; Gutierrez Adan và cs, 2001[81]; Paloma và cs, 2003[143]...) và loại thứ hai là 5%CO2+5%O2+90%N2 (Olson và cs, 1995[140], Holm và cs, 1999[91], Jacobsen và cs, 2000[95]; Bing và cs, 2003[32]...).
Khi tiến hành kỹ thuật IVM/IVF/IVC từ các trứng bò thu từ buồng trứng ở các giống bò sữa Nhật Bản, Mỹ, Pháp, Bỉ...: tỉ lệ trứng thành thục đạt từ 70-95%, tỉ lệ phân chia đạt từ 60-85%, tỉ lệ phôi nang đạt từ 7-50% và nhìn chung kết quả đậu thai dao động trong khoảng 20-50% khi cấy các phôi này (Ball và cs, 1983[28]; Criser và cs, 1984[50]; Fukushima và cs, 1985[73]; Xu và cs, 1987[177]; Fukuda và cs, 1990[68]; Guyader-Joly và cs, 1996[82], Paloma Duque và cs, 2003[143]; Ali và cs, 2003[20]...).
Hiệu quả sản xuất phôi từ trứng của hai giống bò vàng và lai Sind là không khác nhau và tỉ lệ phôi nang thu nhận là 24,64-27,62% (bảng 3.30, hình 3.33).
Kết quả này t−ơng đối ổn định, so sánh với kết quả của các tác giả khác khi tiến hành thụ tinh ống nghiệm từ nguồn trứng bò Holstein Friesian thì kết quả của chúng tôi nằm trong khoảng bình th−ờng vì nh− đã nói trong phần trên, tỉ lệ phôi nang của họ đạt từ 7% đến 50% tùy điều kiện thí nghiệm cũng nh− lô thụ tinh.
Các kết quả nghiên cứu đã trình bày ở trên đã góp phần xây dựng ph−ơng pháp nuôi phôi bò in vitro từ giai đoạn phân chia đến khi thu đ−ợc các phôi nang có chất l−ợng tốt và ổn định trên cơ sở sử dụng các môi tr−ờng nuôi tổng hợp (199, SOF, KSOM, B2) có bổ sung các loại tế bào khác nhau (cumulus, Vero, tế bào ống dẫn trứng), nồng độ khí CO2, O2 và mật độ nuôi phôi thích hợp.
70.05 72.38 38.65 40 38.65 40 24.64 27.62 0 10 20 30 40 50 60 70 80%
Phân chia Phôi dâu Phôi nang
Hình 3.33: So sánh khả năng sản xuất phôi ống nghiệm ở bò vàng và bò lai Sind
Bò vàng Bò lai Sind