trong ống nghiệm
Tiến hành thu trứng (mùa thu-đông) và nuôi thành thục trứng bò vàng (nA= 250; nB=212) và bò lai Sind (nA= 184; nB=166) trong môi tr−ờng 199+10%FCS có bổ sung FSH, LH và E. Nhiệt độ tủ nuôi là 39oC, 5%CO2. Sau 24-26 giờ, lấy các trứng ra đánh giá sự thành thục thông qua kiểm tra sự xuất hiện của cực cầu thứ nhất. Kết quả đ−ợc trình bày trong bảng 3.11.
Bảng 3.11: Kết quả nuôi thành thục trứng bò vàng và bò lai Sind trong ống nghiệm. Số trứng (n) Trứng thành thục (n) (%) Bò vàng Trứng loại A 250 178 71,2a Trứng loại B 212 128 60,38b Bò lai Sind Trứng loại A 184 135 73,37a Trứng loại B 166 102 61,45b a, b (P < 0,05)
Kết quả trong bảng 3.11 cho thấy không có sự khác nhau về tỉ lệ thành thục của trứng loại A ở hai giống bò này (71,2% so với 73,37%; P>0,05). Điều này cũng đúng với các trứng loại B (60,38% so với 61,45%; P>0,05).
Đồng thời có sự khác nhau rõ rệt giữa khả năng thành thục ống nghiệm của các trứng loại A và B: ở bò vàng là 71,2% so với 60,38% (P<0,05); ở bò lai Sind là 73,37% so với 61,45% (P<0,05).
Trứng bò hút ra khỏi nang và nuôi trong các môi tr−ờng tổng hợp có khả năng tự thành thục và thậm chí thụ tinh đ−ợc với tinh trùng trong ống nghiệm (Iritani và Niwa, 1977)[93], tuy nhiên khả năng phát triển của các phôi này rất kém so với các phôi thụ tinh ống nghiệm từ các trứng đã thành thục in-vivo tr−ớc đó (Leibfried-Rutledge và cs, 1986a)[107]. Để giúp trứng có thể đạt đ−ợc khả năng thành thục tốt hơn (thành thục nhân và nguyên sinh chất) khi đ−ợc nuôi in vitro, một số yếu tố thuộc về môi tr−ờng nuôi đã đ−ợc bổ sung. Đó là các hocmon FSH, LH, E, tế bào granulose và huyết thanh bò. ảnh h−ởng d−ơng tính của sự bổ sung này không những đối với sự thành thục của trứng ở giai đoạn nuôi ban đầu, mà còn ảnh h−ởng đến kết quả tiếp theo khi tiến hành thụ tinh ống nghiệm và nuôi phôi sau này (Fukushima và Fukui, 1985)[73].
Môi tr−ờng 199 đ−ợc sử dụng phổ biến để làm môi tr−ờng nuôi thành thục trứng và việc bổ sung các chất nh− LH, FSH, Estradiol, huyết
thanh bò, pyruvate Na.... là hết sức cần thiết nhằm đảm bảo sự phát triển bình th−ờng và đầy đủ của trứng đến giai đoạn thành thục đồng thời cả nhân trứng, bào t−ơng và lớp màng trong suốt nh− trong phần trên đã đề cập.
Trong các nghiên cứu liên quan đến việc khai thác và nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm của các tác giả khác, ngoài việc sử dụng môi tr−ờng 199 (Moor và Trouson, 1977[125]; Staigmiller và Moor, 1984[167]; Katska và Smorag, 1985[97]; Merton và cs, 1999[122]), ng−ời ta còn sử dụng môi tr−ờng Ham’s F-10 (Xu và cs, 1987)[177], môi tr−ờng TALP (Ball và cs, 1983[28]; Criser và cs, 1984[50]), môi tr−ờng Ham’s F-12 (Fukushima và cs, 1985)[73]. 11.67 21.93 37.42 56.67 71.19 0 20 40 60 80 % MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 Môi tr−ờng nuôi Tỉ lệ thành thục Hình 3.16: So sánh tỉ lệ thành thục của trứng trong các môi tr−ờng nuôi khác nhau
MT1: môi tr−ờng 199
MT2: môi tr−ờng 199+10%FCS MT3: môi tr−ờng 199+10%FCS+FSH MT4: môi tr−ờng 199+10%FCS+FSH+E MT5: môi tr−ờng 199+10%FCS+FSH+E+LH
Kết quả của chúng tôi cho thấy môi tr−ờng 199+FSH+LH+E (MT5) là cho kết quả tốt và ổn định với 70% trứng đ−a vào nuôi đạt đ−ợc trạng thái thành thục (bảng 3.4, 3.5, 3.6, 3.7), đây là tỉ lệ cao nhất so với các môi tr−ờng đã sử dụng.
Sự xuất hiện thể cực thứ nhất cũng nh− trạng thái nhiễm sắc thể Metaphase II th−ờng đ−ợc quan sát thấy ở vào khoảng 18-28 giờ kể từ lúc
bắt đầu đ−a vào nuôi trong ống nghiệm; cụ thể ở bò là 18-21 giờ, cừu 24 giờ, dê 27 giờ (Thibault và cs, 1991)[187].
Với khoảng thời gian nuôi 24-28 giờ, cho phép thu đ−ợc 70-90% các trứng đạt tới trạng thái thành thục hoàn chỉnh, nghĩa là sẵn sàng để tham gia vào quá trình thụ tinh một cách bình th−ờng mà 35-50% trong số chúng có thể phát triển đến giai đoạn phôi nang sau này (Pinyopummintr và cs, 1991[151]; Lim và cs, 1994[109]; Eckert và cs, 1995[56]; Keskintepe và cs, 1995[99]; Van Soom và cs, 1996[173]; Krisher và cs, 1998[100]; Holm và cs, 1999[91]; Gomez và cs, 2000[77]; Numabe và cs, 2000[136]; Paloma và cs, 2003[143]; Pulglisi và cs, 2004[152]; Oikawa và cs, 2005[138]).
Nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả khác trên thế giới cũng khẳng định kết quả nuôi trứng thành thục cũng nh− thụ tinh trong ống nghiệm phụ thuộc rất lớn vào chất l−ợng trứng đ−ợc đ−a vào tr−ờng nuôi (Keskintepe và cs, 1995[99]; Van Soom và cs, 1996[173]; Krisher và cs, 1998[100]; Holm và cs, 1999[91]; Gomez và cs, 2000[77]).
Thời gian nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm của chúng tôi là không khác so với các tác giả khác: trung bình 24-28 giờ (bảng 3.8, hình 3.17). Dĩ nhiên tỉ lệ thành thục phụ thuộc vào chất l−ợng trứng ban đầu (bảng 3.9).
0 20 40 60 80 0 5 10 15 20 25 30 35
Thời gian nuôi (giờ)
%
Tỉ lệ trứng thành thục
Hình 3.17: Sự phụ thuộc của tỉ lệ trứng thành thục vào thời gian nuôi
Kể từ khi con bê đầu tiên ra đời bằng pháp pháp thụ tinh trong ống nghiệm vào năm 1981 (Brackett và cs, 1982)[38], các nghiên cứu nhằm cải thiện ph−ơng pháp và hiệu quả của thụ tinh ống nghiệm trên đối t−ợng động vật đã không ngừng phát triển. Trong đó, chất l−ợng trứng thành thục để đ−a vào thụ tinh ống nghiệm ảnh h−ởng rất lớn đến kết quả (Sirard và cs, 1988)[164].
Chất l−ợng trứng ban đầu ảnh h−ởng trực tiếp đến tỉ lệ thành thục trong ống nghiệm. Trong một nghiên cứu của Shioya và cs (1988)[161], khi nghiên cứu nuôi thành thục và thụ tinh ống nghiệm ở bò Holstein, các tác giả thu buồng trứng, thu trứng và phân loại trứng thành các loại A, B và C. Theo sự phân loại này, trứng A là những trứng có nhiều lớp tế bào cumulus dày đặc bao quanh, trứng B là những trứng có lớp tế bào cumulus bao quanh nh−ng không dày đặc, trứng C là những trứng trần, không có lớp tế bào cumulus bao quanh. Các trứng A, B và C nói trên đ−ợc nuôi thành thục trong môi tr−ờng 199-Hepes có bổ sung 10%FCS, hocmon FSH, LH và E. Sau đó chúng đ−ợc thụ tinh ống nghiệm và đánh giá tỉ lệ thành thục, kết
quả đối với trứng loại A, tỉ lệ thành thục đạt 97,4%, loại B đạt 89,8% và loại C chỉ đạt 52,9%.
Kết quả nghiên cứu của Newton và cs (1988)[130] về khả năng thành thục trong ống nghiệm của 310 trứng bò thu từ buồng trứng cho thấy: tỉ lệ trứng phát triển, đạt đến giai đoạn thành thục dao động từ 84%-95%. Kết quả nuôi thành thục trứng bò sữa (New Zealand) của Fukui và cs (1991)[71] là 82,9% trong môi tr−ờng 199 có bổ sung FSH, LH và Estradiol.
Điều đáng nói là trứng loại A thu đ−ợc trong các mùa khác nhau có tỉ lệ thành thục trong ống nghiệm không khác nhau (bảng 3.10). Điều này tạo thuận lợi cho những nghiên cứu liên tục trong năm đối với chuyên ngành công nghệ phôi.
Tóm lại, các thí nghiệm và kết quả trình bày ở phần trên khẳng định sự ổn định của kỹ thuật nuôi trứng bò vàng và bò lai Sind thành thục trong ống nghiệm trên cơ sở sử dụng môi tr−ờng 199 có bổ sung hocmon FSH, LH và Estradiol-17β.
3.3 thụ tinh trứng bò trong ống nghiệm
Mục đích của thí nghiệm là đánh giá khả năng thụ tinh trong ống nghiệm của trứng bò nội sau khi đã nuôi thành thục trong ống nghiệm với tinh trùng đã xử lý. Nội dung nghiên cứu bao gồm đánh giá khả năng xử lý tinh trùng bằng ph−ơng pháp lọc qua