Tinh đông lạnh dạng cọng rạ (0,25ml) của các đực giống Holstein Friesian có ký hiệu A-6, A8 và A5 đ−ợc sử dụng trong các thí nghiệm.
Các cọng tinh đông lạnh nói trên đ−ợc bảo quản tốt trong nitơ lỏng và tinh trùng đ−ợc giải đông ở nhiệt độ 37°C trong 1 phút, mỗi lần dùng 1 cọng rạ có số l−ợng tinh trùng sống trên 15 triệu sau giải đông, trong đó hơn 30% là tinh trùng có chất l−ợng tốt, vận động tiến thẳng.
Tinh trùng sau giải đông đ−ợc rửa 3-4 lần trong môi tr−ờng BO cải tiến. Ly tâm thu tinh trùng 700g trong 5 phút.
Tiếp đó, tinh trùng đ−ợc xử lý theo một trong hai ph−ơng pháp sau: Ph−ơng pháp bơi ng−ợc: tinh trùng đ−ợc đ−a vào tủ nuôi (incubator) ở nhiệt độ 39oC, 5%CO2. Sau 45-60 phút, tinh trùng đã sẵn sàng để đ−a vào môi tr−ờng thụ tinh (Parrish và cs, 1986b)[148].
Ph−ơng pháp lọc qua phân lớp percoll: tinh trùng đ−ợc lọc qua phân lớp percoll (90%/45%) trong 15-30 phút, thu phần tinh trùng bên d−ới. Dùng những tinh trùng này cho vào môi tr−ờng thụ tinh với trứng đã thành thục (Gutierrez Adan và cs, 2001)[81].
Môi tr−ờng BO cải tiến có thành phần nh− sau (dùng pha 1 lít):
Hóa chất Khối l−ợng (gram)
NaCl 6,55 KCl 0,3
CaCl2.2H2O 0,33
MgCl2.6H2O 0,106 NaHCO3 3,104 Glucose 2,5 Na pyruvate 0,137 BSA 3,0 Penicillin 0,031 2.2.7 Thụ tinh ống nghiệm
Trứng bò sau khi nuôi thành thục đ−ợc đ−a vào thụ tinh cùng với tinh trùng đã xử lý ở các nồng độ khác nhau. Môi tr−ờng thụ tinh INRA, IVF-1 và IVF-2 có bổ sung 1àM epinepherine, 10àM hypotaurine, 20àM penicillamine và heparin với các nồng độ khác nhau.
Toàn bộ quá trình thụ tinh trên xảy ra trong tủ nuôi với nhiệt độ 39°C, 5%CO2, 95% không khí và độ ẩm bão hoà.