Đây là một điều kiện bắt buộc đối với các tinh trùng tham gia vào quá trình thụ tinh in vitro.
Hiện tợng kiện toàn năng lực thụ tinh (capacitation) của tinh trùng đ- ợc phát hiện bởi Austin (1951)[23] trên chuột và Chang (1951)[45] trên thỏ khi tiến hành thụ tinh bằng các tinh trùng trong ống dẫn trứng. Cả hai ông đều chỉ ra rằng, các tinh trùng trong tinh dịch khi phóng tinh đều không có khả năng thụ tinh trực tiếp với trứng mà chúng phải trải qua một thời gian nhất định trong đờng sinh dục con cái để đạt tới khả năng thụ tinh.
Các biến đổi sinh lý, sinh hóa ở tinh trùng dẫn đến khả năng tơng tác một cách hiệu quả giữa tinh trùng và trứng đợc gọi là sự kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng (Austin, 1960[24], 1967[25]; Bedford, 1970[30]; Yanagimachi, 1981[178]).
Một trong những vấn đề quan trọng nhất của sự kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng là sự diễn ra các biến đổi sinh lý, sinh hóa của màng sinh chất của tinh trùng. Sự loại bỏ từng bớc hoặc sự thay thế các lipoprotein ngoại vi, sự sắp xếp lại các lipoprotein nội màng, sự khử cholesterol màng và các thay đổi trong việc phân bố cũng nh thành phần của một số phospholipit màng, tất cả chúng đều đóng góp vào sự biến đổi màng nói trên (Yanagimachi, 1981[178]; Cooper, 1986[49]; Yanagimachi, 1988[179]; Eddy, 1988[57], Parrish và cs, 1989[146]).
Để có thực tiễn cũng nh để tìm hiểu những cơ chế của sự kiện toàn năng lực thụ tinh, ngời ta đã thăm dò việc thụ tinh bằng những tinh trùng đ- ợc kiện toàn năng lực thụ tinh in vitro. Những lần thụ tinh in vitro đầu tiên trong những điều kiện nh vậy đã đạt kết quả đối với loài gậm nhấm (chuột đồng, 1963; chuột nhắt, 1968), sau đó là đối với ngời (1969), còn với đại gia súc thì muộn hơn nhiều (1981-1990).
Thời gian kiện toàn năng lực thụ tinh in vitro của tinh trùng bò, cừu, dê, lợn và ngựa cũng lâu hơn nhiều (4-6 giờ) so với ngời và các loài gậm nhấm bé và vấn đề đặt ra là phải duy trì sức hoạt động in vitro trong nhiều giờ.
Trong công nghệ thụ tinh ống nghiệm, xử lý nhằm kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng là một khâu quan trọng, ảnh hởng trực tiếp đến kết quả thụ tinh ống nghiệm sau này.
Phơng pháp kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng in vitro
Cơ sở của các phơng pháp kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng
in vitro là dựa trên những hiểu biết về quá trình này đã xảy ra trong tự nhiên (in vivo).
Các quan tâm liên quan qúa trình này bao gồm:
- Loại bỏ tinh thanh và pha loãng tinh trùng trong các môi trờng cho phép xảy ra sự kiện toàn năng lực thụ tinh, đồng thời chú ý giữ cho đợc sự vận động tự nhiên của chúng. Thành phần và tính chất của các môi trờng sử dụng vào mục đích này đợc pha chế trên cơ sở những hiểu biết về các chất tiết trong ống dẫn trứng (môi trờng B2), hoặc huyết thanh (môi trờng 199, Hank’s), hoặc đơn giản chỉ là những biến thể của môi trờng nớc muối (môi trờng Tyrode, Krebs-Ringer), hoặc phổ biến hơn nữa là sử dụng môi trờng Phosphate Buffered Saline (PBS).
- Cần có sự hiện diện của chất mang cholesterol là huyết thanh hay albumin huyết thanh, chúng đảm bảo cho việc bảo vệ màng tế bào. Huyết thanh là có hiệu quả hơn albumin huyết thanh nhờ những lipotrotein (HDL, LDL, VLDL) có khả năng thu giữ cholesterol tốt hơn (11%, 40% và 44% so với 7%). Dịch nang trứng cũng là một chất mang có hiệu quả vì nó có chứa HDL.
- Sự có mặt của heparin trong môi trờng kiện toàn năng lực thụ tinh cải thiện đáng kể hiệu quả thụ tinh ống nghiệm ở bò. Giống nh glycosaminoglycan, chất heparin luôn có mặt trong chất tiết của tử cung và ống dẫn trứng của bò và cừu. Điều này, trớc đây đã đợc ngời ta lu ý nhiều.
Vai trò đáng kể của heparin trong môi trờng kiện toàn năng lực thụ tinh là rõ ràng, tuy nhiên, kiểu tác động của nó nh thế nào thì đến nay vẫn còn cha sáng rõ. Ngời ta chỉ biết rằng, heparin làm thuận lợi cho việc đi vào màng tinh trùng của ion Ca+2 (Handrow và cs, 1989)[85].
Tuy nhiên, những điều kiện không thể thiếu trong in vivo để đảm bảo cho những thay đổi của protein màng (ví dụ nh pH thấp, hoạt tính của các enzym khác nhau...) lại là không có trong in vitro. Nhng vì quá trình kiện toàn năng lực thụ tinh vẫn xảy ra trong in vitro, nên ngời ta phải công nhận rằng tự bản thân các tinh trùng đã đóng góp vào việc tạo nên các điều kiện cần thiết để có thể tự kiện toàn năng lực thụ tinh của chúng. Từ đó, ngời ta đa ra một giả thuyết là cần thiết phải ủ tinh trùng với một nồng độ cao (Nagai và cs, 1984)[128].
Khi ủ ở nồng độ cao, khoảng 10% hay hơn thế, các tinh trùng tự chúng giải phóng chất chứa trong acrosom, và nhờ nồng độ các enzym giải phóng ra đó, khi chúng đạt tới một mức đủ, chúng sẽ làm thay đổi thành phần màng của những tinh trùng khác.
Trong in vitro, không có những protein bao phủ có nguồn gốc từ tử cung hay vòi trứng, điều này giải thích vì sao trong in vitro không thể giữ đợc tinh trùng tồn tại lâu 24-36 giờ nh trong in vivo.
Dới đây là một số phơng pháp xử lý tinh trùng bò dùng trong thụ tinh ống nghiệm đợc sử dụng ở các phòng thí nghiệm:
- Phơng pháp bơi ngợc (swim-up):
Tinh trùng đông lạnh trong cọng rạ đợc giải đông ở 35oC trong vòng 1 phút. Toàn bộ tinh trùng đợc cho vào môi trờng TALP trong 1 giờ ở 39oC. Thu lấy phần tinh trùng bên trên và ly tâm 200g trong 10 phút. Những tinh trùng này đạt tiêu chuẩn đa vào môi trờng thụ tinh (Parrish, 1986b)[148].
- Phơng pháp ly tâm :
Tinh trùng đông lạnh dạng cọng rạ (0,25ml) đợc giải đông trong nớc ấm (37oC) và rửa 3 lần trong môi trờng BO (thành phần nh bảng dới). Môi trờng này đợc bổ sung 5mM caffein, ly tâm thu tinh trùng ở 700g trong 5
phút. Tiếp đó, tinh trùng đợc ủ trong tủ nuôi (incubator) trong vòng 2-3 giờ, tủ nuôi có chế độ 5%CO2. Tinh trùng thu đợc lúc này đã sẵn sàng để đa vào môi trờng thụ tinh (Goto và cs, 1988)[80].
- Phơng pháp lọc qua phân lớp percoll:
Tinh trùng đông lạnh dạng cọng rạ đợc giải đông trong nớc ấm 35- 37oC. Chúng đợc cho lên lớp percoll với các nồng độ khác nhau (90%/45%), ly tâm 20-30 phút ở 700g. Phần lắng xuống đáy là những tinh trùng khỏe, đạt tiêu chuẩn đa vào môi trờng thụ tinh (Gutierrez-Adan và cs, 2001)[81].
Đánh giá sự kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng
Một số tác giả đã có ý định chứng minh hoặc làm rõ hiện tợng kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng bằng cách sử dụng chỉ thị huỳnh quang trên màng sinh chất của tinh trùng (lectine, chlortetracyline) hay những kháng thể đặc hiệu.
Các lectin là những phân tử có ái lực đặc biệt với những chất glycosyl. Khi chúng đợc cắt bởi vị trí isothiocynate fluorescein, nó cho phép phát hiện ra những thay đổi tạm thời trong sự phân bố phân tử đờng của màng ngoài của tinh trùng. Schwartz và cs, (1979)[157] và Fraser (1984)[66] đã chỉ ra đợc rằng: có sự giảm về số các vị trí cố định của lectin trong quá trình kiện toàn năng lực thụ tinh.
Chlortetracycline là một phức fluorescent của một số cation hóa trị hai mà chúng bám vào các protein màng của tinh trùng và nó phát ra, trong sự có mặt của ion Ca+2, một huỳnh quang với cờng độ thay đổi. Chỉ thị này cho phép xảy ra tiếp đó các thay đổi trên màng và một số tác giả đã sử dụng điều này để làm chỉ thị cho sự kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng (Ward và Storey, 1984)[175].
Trong khi kiện toàn năng lực thụ tinh, có sự loại trừ một số protein khỏi bề mặt của tinh trùng. Những protein này có nguồn gốc từ chất tiết của các tuyến phụ và dịch của phụ dịch hoàn. Sử dụng kháng huyết thanh (Oliphant và Brackett, 1973)[139] cho phép thấy đợc sự giảm ngng kết của
tinh trùng và sự tăng dần của thời gian sống của tinh trùng trong đờng sinh dục của con cái.
Tuy nhiên, không một kiểm định nào tách bạch thật sự đợc giữa sự kiện toàn năng lực thụ tinh và phản ứng thể đỉnh. Vì vậy trong thực tế, các lectin, chlortetracyclin và một số kháng thể thờng đợc sử dụng chung cho cả việc xác định phản ứng thể đỉnh.
Kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng in vitro trên đối tợng vật nuôi có nhiều khó khăn hơn là trên ngời và loài gậm nhấm. Một trong các yếu tố gây ra khó khăn này là thời gian cần thiết để hoàn thành sự kiện toàn năng lực thụ tinh ở ngời và loài gậm nhấm là ngắn (1-2 giờ), trong khi đó lại khá dài trên các loài vật nuôi (nhiều giờ). Trong trờng hợp này, vấn đề lớn đặt ra là làm thế nào để có đợc các điều kiện nuôi in vitro vừa đảm bảo cho sự sống bình thờng vừa giữ đợc khả năng vận động tốt của tinh trùng.
Brackett và cs (1982)[37] đã nuôi một thời gian ngắn các tinh trùng bò và ngựa trong môi trờng HIS (high ionic strength). Môi trờng này cho phép loại bỏ một số protein trên bề mặt tinh trùng. Sự có mặt của albumin và heparin trong môi trờng nuôi trên đợc đặt cơ sở trên những hiểu biết về chúng trong dịch nang trứng và môi trờng tiết của tử cung, ống dẫn trứng in-vivo. Việc bổ sung albumin vào môi trờng có thể đóng góp vào sự kiện toàn năng lực thụ tinh các tinh trùng nhờ khả năng cố định sterol của nó (Langlais và cs, 1988)[104].
Các glycosaminoglycan đợc đề nghị sử dụng nh một chất góp phần quan trọng trong quá trình kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng bò
in vitro (Brackett và Oliphant, 1975[35]; Parrish và cs, 1989[146]). Mặc dù cơ chế cụ thể của heparin còn cha xác định rõ nhng rõ ràng là sự có mặt của nó trong môi trờng kiện toàn năng lực thụ tinh đã làm tăng dòng Ca+2 đi vào tế bào tinh trùng (Handrow, 1989)[85] và ảnh hởng đến pH nội màng tế bào tinh trùng bò (Parrish và cs, 1989)[146].
Sau đây là bảng tóm tắt lịch sử thụ tinh ống nghiệm ở các loài, điều lu ý ở đây là các mốc thời gian liên quan đến việc sử dụng tinh trùng đã kiện toàn năng lực thụ tinh in vivo hay in vitro.
Bảng 1.4: Thụ tinh in vitro ở các loài có vú với tinh trùng đợc kiện toàn năng lực thụ tinh in vitro và in vivo.
Kiện toàn năng lực thụ tinh Noãn bào thành thục in vivo
In vivo In vitro 1954 Thỏ + 1963 Chuột đồng + 1968 Chuột nhắt + 1969 Ngời + 1970 Chuột nhắt + 1970 Mèo + 1972 Chuột lang + 1973 Khỉ + 1976 Thỏ + 1977 Mèo + 1978 Chó + 1982 Bò + 1985 Dê + 1986 Cừu + 1986 Lợn + 1990 Ngựa +
Noãn bào thành thục in vitro
1970 Chuột nhắt + 1973 Thỏ + 1986 Cừu + 1986 Bò + 1988 Lợn + 1990 Dê +
Phơng pháp đánh giá sự kiện toàn năng lực thụ tinh có độ tin tởng cao nhất chính là khả năng tinh trùng xuyên qua đợc màng của trứng cùng loài. Do vậy, kết quả thụ tinh ống nghiệm (sự phân chia của phôi) cho phép phản ảnh hiệu quả của quá trình xử lý nhằm kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng.