Thibault là một trong những ngời đầu tiên nuôi trứng bò trong ống nghiệm (Thibault, 1966)[186], tiếp đó, các nghiên cứu nhằm thụ tinh và
nuôi phôi bò cũng đợc bắt đầu (Screenan, 1968[158], Seidel và cs, 1971[159], Renard và cs, 1976[153]; Iritani và cs, 1977[93]...).Tinh trùng bò đã kiện toàn năng lực thụ tinh đợc đa vào nuôi chung với trứng đã thành thục. Nồng độ tinh trùng đợc tính toán sao cho đạt khoảng 10.000-100.000 tinh trùng/trứng. Tinh trùng đợc ủ với trứng trong vòng 18-24 giờ trong điều kiện 39oC, 5%CO2 (Brackett và cs, 1978[39]; Ball và cs, 1983[28]; Criser và cs, 1984[50]; Iritani và cs, 1984[94]; Fukushima và cs, 1985[73]; Xu và cs, 1987[177]; Fukuda và cs, 1990[68]; Funahashi và cs, 1991[74]; Guyader-Joly và cs, 1996[82]; Kajihara và cs, 1999[96]...).
Thông thờng, các phòng thí nghiệm dùng tinh đông lạnh-giải đông để sử dụng cho các nghiên cứu về thụ tinh ống nghiệm. Việc giải đông đợc tiến hành trong nớc ấm 37oC trong vòng 1 phút. Ngoài ra cũng cần loại bỏ các môi trờng đã sử dụng để bảo quản tinh trùng, bằng cách ly tâm pha loãng trong một số môi trờng thích hợp (ví dụ môi trờng PBS, 199...), ngời ta thu đợc đủ số tinh trùng sẽ dùng trong quá trình tiếp theo (Hanada và cs, 1986[84]; Goto và cs (1992)[79] ; Palmer và cs, 1990)[184]).
Ngoài ra, có thể thụ tinh ống nghiệm trứng bò bằng cách tiêm tinh trùng vào trứng (ICSI) (Oikawa cs, 2005)[138]. Phơng pháp này cho phép tiêm từng tinh trùng vào trứng với các đòi hỏi về thiết bị bộ kính hiển vi vi thao tác và tay nghề cao của ngời thực hiện. Tinh trùng dùng để tiêm vào trứng có thể là tinh trùng tơi hoặc đông lạnh-giải đông ở 37oC (Chung và cs, 2000)[48].
Đặc biệt, hiện nay khi kỹ thuật tách tinh trùng đực/ cái đã có kết quả trên thiết bị chuyên dụng Flowcytometer thì việc sử dụng tinh trùng đã xác định giới tính vào lĩnh vực thụ tinh ống nghiệm bò ngày càng đợc quan tâm (Lu và cs, 1999)[116].
Sau khi thụ tinh in vitro, hợp tử đ−ợc tiếp tục nuôi trong các môi tr−ờng thích hợp để phát triển đến giai đoạn phôi dâu-phôi nang.
Tr−ớc đây, các phôi thụ tinh ống nghiệm đợc nuôi trong tử cung của vật mang trung gian (thỏ, cừu) và ngời ta gọi đây là ph−ơng pháp nuôi phôi
in vivo. Phơng pháp này hiện nay không còn đ−ợc sử dụng rộng rãi.
Ngày nay, ngời ta đã thay thế ph−ơng pháp nuôi phôi in vivo bằng phơng pháp in vitro dựa trên những hiểu biết về thành phần môi tr−ờng ống dẫn trứng, tử cung... để tổng hợp các loại môi tr−ờng nuôi thích hợp. Sau đây là hai phơng pháp nuôi phôi in vitro đợc sử dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm trên thế giới.
Phơng pháp nuôi phôi trong sự có mặt của các tế bào bổ sung (co- culture): môi trờng cơ bản đợc dùng là môi trờng 199, B2.... và tế bào bổ sung là các tế bào sinh dỡng có nguồn gốc khác nhau. Có thể kể đến là tế bào MDBK (madin darby bovine kidney), BRL (buffalo rat liver), Vero (cellules de rein de singe vert) hoặc các loại tế bào ống dẫn trứng, tế bào cumulus, tế bào granulose... (Lu và cs, 1987[118], 1988[117]; Richard và cs, 1993[154]; Ferry và cs, 1994[64]).
Phơng pháp nuôi phôi trong môi trờng tổng hợp: đây là những môi trờng có thành phần tơng tự môi trờng ống dẫn trứng, dịch tiết tử cung... nhằm đảm bảo cho phôi phát triển bình thờng. Có thể kể đến là môi trờng SOF (synthetic oviduct fluid), CR1 (milieu de Rosekrans), BMOC-3 (milieu de Brinster)...(Eckert và cs, 1995[56], Guyader-Joly và cs, 1996[82], Paloma Duque và cs, 2003[143]; Ali và cs, 2003[20]).
Ngoài ra, có thể bổ sung vào các môi trờng nói trên các yếu tố thúc đẩy sự tăng trởng nh IGF-1, TGF, EGF (Lonergan và cs, 1996[113]; Sirisathien và cs, 2003[165]; Mtango và cs, 2003[126]).
Sự kết hợp các yếu tố môi trờng, thành phần khí nuôi, chế độ nuôi, nhiệt độ nuôi, loại tế bào bổ sung ... là các vấn đề cơ bản và quan trọng, tác động trực tiếp đến hiệu quả thụ tinh ống nghiệm.
Bảng 1.5: Các giai đoạn phát triển của phôi bò in vitro.
Thời gian Giai đoạn
Giờ Ngày Phát triển của phôi
24 1 Hợp tử-2 tế bào
48 2 2-4 tế bào
72 3 4-8 tế bào
96 4 8-16 tế bào
120 5 Phôi dâu
144 6 Phôi dâu-Phôi nang
168 7 Phôi nang
Ghi chú: ngày thụ tinh in vitro đợc tính là ngày 0
Bảng 1.6: Số tế bào (xấp xỉ) trong phôi nang bò ở các giai đoạn khác nhau. Giai đoạn phát triển của phôi nang Số tế bào phôi
Bắt đầu có khoang 100
Khoang hình thành rõ 120
Phôi nang căng phồng 160
Phôi nang chui ra khỏi màng sáng 200 Phôi nang có dạng tròn ở ngày 11-12 1000