Để có thể đánh giá sự thành thục của trứng bò đ−ợc nuôi trong ống nghiệm, cần phải nhuộm nhân hoặc nhiễm sắc thể của trứng. Điều đáng tiếc là biện pháp này sẽ không cho phép chúng ta tiếp tục sử dụng trứng cho những mục đích tiếp theo nh− thụ tinh ống nghiệm, cấy chuyển nhân (nuclear transfer). Tuy nhiên, có những dấu hiệu bên ngoài có thể quan sát thấy, giúp chúng ta đánh giá đ−ợc sự thành thục của trứng sau thời gian nuôi trong ống nghiệm. Đó là các căn cứ dựa trên sự tơi bông của các tế bào cumulus bao quanh trứng, hoặc sự xuất hiện của thể cực thứ nhất (Leibfried và cs, 1979[106]).
Thông th−ờng, để đánh giá sự thành thục của nhân trứng, ng−ời ta tiến hành nhuộm nhân của lô trứng đối chứng bằng thuốc nhuộm Orcein 1%. Kết quả thu đ−ợc đ−ợc dùng nh− một thông số tham khảo cho các lô trứng cùng nguồn gốc, chất l−ợng ban đầu hoặc cùng ph−ơng pháp và điều
kiện nuôi thành thục. Việc đánh giá sự thành thục của nguyên sinh chất là rất khó.
Hiện nay, khi các kỹ thuật nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm, thụ tinh ống nghiệm và nuôi phôi trong ống nghiệm đã trở thành một tổ hợp công nghệ sinh học hoàn chỉnh thì việc đánh giá kết quả của giai đoạn nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm th−ờng đ−ợc phản ảnh qua kết quả thụ tinh ống nghiệm (số hợp tử phân chia ở giai đoạn 2 tế bào) và kết quả nuôi phôi trong ống nghiệm (số phôi dâu, phôi nang) thu đ−ợc về sau (Paloma Duque và cs, 2003[143]).
1.1.3 Các yếu tố ảnh h−ởng kết quả khai thác và nuôi thành thục
trứng bò trong ống nghiệm
Bê thụ tinh ống nghiệm đầu tiên của thế giới ra đời tại Mỹ vào năm 1981 (Brackett và cs, 1982)[36]. Con bê đực này là kết quả cấy phôi thụ tinh ống nghiệm có nguồn gốc từ một trứng đã thành thục in vivo tr−ớc đó. Trong những năm đầu thực hiện kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm, ng−ời ta tiến hành thu trứng đã thành thục in vivo bằng kỹ thuật gây rụng trứng nhiều trên bò cho trứng. Có thể thu trứng từ trong những nang sắp rụng hoặc thu trứng từ vòi trứng ngay sau khi xác định thời điểm chắc chắn trứng đã rụng.
Các trứng thành thục in vivo cho kết quả thụ tinh ống nghiệm và phôi phát triển sau đó là bình th−ờng (Brackett và cs, 1982[36]; Leibfried- Rutledge và cs, 1986a[107]). Kết quả của Leibfried-Rutledge và cs cho thấy với cả hai loại trứng thành thục in vivo (hoặc là hút từ nang trứng sắp rụng, hoặc là thu từ vòi trứng) đều cho tỉ lệ phôi phân chia và phôi nang sau thụ tinh ống nghiệm là rất đáng khích lệ. Kết quả trong lô trứng thành thục
in vivo và hút từ các nang sắp rụng, tỉ lệ phôi phân chia đạt 82%, tỉ lệ phôi nang đạt 45%; kết quả này ở lô trứng thành thục in vivo thu từ vòi trứng lần l−ợt là 68% và 25%.
Bằng việc sử dụng các dụng cụ nội soi, ng−ời ta có thể tiến hành lặp đi lặp lại khả năng hút trứng từ các nang trên bề mặt buồng trứng nhiều lần ở cùng một con vật cho trứng. Ph−ơng pháp này đ−ợc thực hiện thành công
bởi các nhóm nghiên cứu của Sirard và cs, (1985)[163]; Lambert và cs, (1986)[103]. Tuy nhiên, một giới hạn lớn trong việc thu trứng in vivo là số l−ợng trứng thu đ−ợc không nhiều, ngay cả khi tiêm cho bò hocmon FSH, số trứng thu đ−ợc cũng chỉ từ 5-10 trứng / bò (Lambert và cs, 1986[103]; Leibfried-Rutledge và cs, 1986a[107]).
Một nguồn trứng lớn, ổn định và rẻ có thể giải quyết mâu thuẫn trên là nguồn trứng từ các lò mổ. Dựa trên một nền chăn nuôi tiên tiến và cơ sở hạ tầng tốt, việc thu trứng từ các bò ở lò mổ hoàn toàn có thể đáp ứng nhu cầu lớn về buồng trứng phục vụ thí nghiệm. Các trứng này có chất l−ợng tốt và ổn định đồng thời lại rẻ hơn rất nhiều.
Việc bảo quản buồng trứng trong quá trình vận chuyển từ nơi thu mẫu về đến phòng thí nghiệm cũng là một yếu tố ảnh h−ởng đến chất l−ợng trứng khai thác từ buồng trứng. Wang và cs, (1995)[174] đã đánh giá khả năng phát triển của trứng bò in vitro sau khi bảo quản ở các nhiệt độ và thời gian khác nhau. Thí nghiệm đ−ợc chia ra 5 lô. Lô 1: buồng trứng đ−ợc bảo quản ở nhiệt độ 25oC trong 24 giờ, lô 2: buồng trứng đ−ợc bảo quản ở 4oC trong 24 giờ, lô 3: buồng trứng đ−ợc bảo quản ở 4oC trong 36 giờ, lô 4: buồng trứng đ−ợc bảo quản ở 4oC trong 48 giờ, lô 5 (đối chứng): trứng đ−ợc hút ra khỏi buồng trứng ngay khi về đến phòng thí nghiệm. Trứng của lô 1 đến 4 đ−ợc hút ra khỏi buồng trứng sau thời gian bảo quản đã nói. Sau khi nuôi thành thục trong ống nghiệm, tỉ lệ trứng không thành thục là cao ở lô 1 (30,3%), lô 2 (46,3%), lô 3 (39,2%), lô 4 (49,2%), trong khi lô 5 chỉ là 10,4%. Sau khi thụ tinh ống nghiệm các trứng của các lô nói trên, tỉ lệ phôi phân chia ở lô 1 là 21,75; lô 2 là 8,9%; lô 3 là 7,7%; lô 4 là 3,7% trong khi lô 5 là 83,0%. Tỉ lệ phôi dâu và phôi nang của các lô trên nh−
sau: lô 1 là 4,8%; lô 2 là 2,4%; lô 3 là 1,7%; lô 4 là 1,0% trong khi ở lô 5 là 58,7%. Kết quả này chứng tỏ quá trình bảo quản buồng trứng có ảnh h−ởng lớn đến chất l−ợng trứng.
Thông th−ờng, việc bảo quản buồng trứng đ−ợc thực hiện ở 30-37oC và vận chuyển buồng trứng từ nơi thu mẫu về phòng thí nghiệm chỉ kéo dài 2-6 giờ.
Ph−ơng pháp khai thác in vivo th−ờng áp dụng để khai thác trứng từ các cá thể cái có tiềm năng di truyền cao, trong giai đoạn hiện nay, kỹ thuật OPU trên bò cũng đ−ợc hoàn thiện dần. Mục đích của ph−ơng pháp OPU là tăng tần số chọn lọc dòng của con mẹ, kết hợp với ph−ơng pháp thụ tinh ống nghiệm (OPU-IVF) cũng nh− kỹ thuật cấy phôi để đạt đến khả năng khai thác tiềm năng sinh học cao nhất một cách chủ động.
Ph−ơng pháp OPU ít gây tổn th−ơng và th−ờng cũng không cần thiết phải xử lý hocmon ở bò thu trứng. Ưu điểm nổi bật của ph−ơng pháp này là ng−ời ta có thể tiến hành thu trứng nhiều lần lặp lại trên cũng một bò cái. Tần số cao có thể đến 2 lần thu trứng /con/ tuần và đ−ợc lặp đi lặp lại trong vòng 5 tháng liên tục. Trung bình có thể thu đ−ợc 5 trứng/1 lần OPU và khoảng 20-30% trong số chúng có thể phát triển thành phôi nang sau khi thụ tinh ống nghiệm. Các phôi này đạt tiêu chuẩn để cấy ngay hoặc đông lạnh bảo quản lâu dài (Bols và cs, 1995[34]; Galli và cs, 2001[75]).
Đối với những bò bình th−ờng về sinh sản, có thể tiêm hocmon để thúc đẩy sự phát triển số l−ợng nhiều nang trên buồng trứng và sau đó tiến hành OPU, tr−ờng hợp này tiến hành thu 1 lần/tuần (Galli và cs, 2001[75]).
Ưu thế của ph−ơng pháp OPU thể hiện rõ khi tiến hành thu trứng nhiều lần trên một cá thể. Nghiên cứu của Kruip và cs (1994)[102] cho thấy, mỗi tuần có thể thu đ−ợc khoảng 13 trứng trên một bò cho và số phôi nang đạt tiêu chuẩn để cấy t−ơng ứng là 2,1 phôi (16%). Do vậy, có thể thu đ−ợc khoảng 50 phôi trên một bò cho trong vòng 6 tháng nếu tiến hành khai thác trứng bằng ph−ơng pháp OPU kết hợp IVF. Điều này đ−ợc đánh giá là −u thế lớn của ph−ơng pháp OPU so với ph−ơng pháp thu phôi bằng kỹ thuật cổ điển (kết hợp gây rụng trứng nhiều, thụ tinh nhân tạo và thu phôi). Hiệu suất của ph−ơng pháp OPU −ớc chừng 4 lần lớn hơn ph−ơng pháp cổ điển trong cùng một chu kỳ thời gian khai thác (Colleau và cs, 1998[181]).
Hiệu suất hút trứng từ nang trứng trong ph−ơng pháp OPU cũng có nhiều biến động. Nghĩa là khi quan sát thấy một số l−ợng nang trứng có thể hút đ−ợc hiện rõ trên màn hình, sau đó, ng−ời thao tác tiến hành chọc hút các nang đó thông qua hệ thống OPU đã trình bày trong phần ph−ơng pháp, thực tế cho thấy số trứng hút đ−ợc là ít hơn so với số nang quan sát thấy trên màn hình. Kết quả trình bày ở bảng 1.2 chứng minh cho điều này :
Bảng 1.2: Tỉ lệ trứng thu đ−ợc so với số nang (Bols và cs, 1995)[34]. STT ca OPU Số bò sử dụng Số nang quan sát thấy và đ−ợc chọc hút Số trứng thu đ−ợc Tỉ lệ trứng thu đ−ợc so với số nang quan
sát (%) 1 1 5 3 60 2 1 2 2 100 3 4 10 6 60 4 4 12 5 42 5 1 5 1 20 6 1 2 0 0 7 8 69 16 23 8 4 29 6 21 9 2 8 5 63 10 4 18 7 39 11 7 22 7 32 12 1 4 1 25 13 7 28 18 64 14 6 21 8 38 15 4 12 4 33 16 5 21 14 67 17 6 23 19 83 Trung bình 291 122 42
Trong thực tế, số l−ợng trứng thu đ−ợc trong mỗi ca OPU là rất biến động, một nghiên cứu của Hasler và cs (1995)[87] khi tiến hành triển khai kết hợp kỹ thuật OPU và IVF (in vitro fertilization) cho thấy: số l−ợng trứng thu đ−ợc trong mỗi ca OPU có thể dao động từ không đến 40 trứng (chiếm 7,2% số ca). Số l−ợng trứng thu bằng ph−ơng pháp OPU khi tiến hành lặp lại trên bản thân con đã cho trứng cũng có những dao động lớn, cũng nh− thế đối với tỉ lệ phôi nang thu đ−ợc khi tiến hành IVF, con số này dao động từ 4-33%. Kết quả dao động này cũng đ−ợc quan sát thấy trên đối t−ợng bò sữa, tỉ lệ này là 6-26%, riêng với giống bò Belgian Blue thì tỉ lệ này nằm trong khoảng 4-38%.
Dựa trên nền các nghiên cứu của Sato và cs (1977a[155], 1977b[156]), ph−ơng pháp nuôi thành thục trứng in vitro đầu tiên đ−ợc phát triển với việc sử dụng môi tr−ờng 199 nh− là môi tr−ờng cơ bản để nuôi thành thục trứng. Để giúp trứng có thể đạt đ−ợc trạng thái thành thục hoàn toàn, việc bổ sung các nguồn protein khác cũng nh− các hocmon (FSH, LH, E) là cần thiết. Năm 1987, Lu và cs [118] công bố việc bổ sung huyết thanh bò động dục và tế bào granulose vào môi tr−ờng nuôi trứng đã dẫn đến hiệu quả thụ tinh ống nghiệm tăng rõ rệt tới 73% các trứng đ−ợc thụ tinh phát triển tiếp đến giai đoạn phôi nang sau khi thụ tinh ống nghiệm và phôi đ−ợc nuôi in vivo trong ống dẫn trứng của cừu.
Đã có nhiều nghiên cứu đ−ợc thực hiện nhằm xác định mối quan hệ giữa kích th−ớc nang và khả năng phát triển của trứng in vitro (Leibfried và First, 1979[106]; Fukui và cs, 1980[72]; Fuhrer và cs, 1989[67]; Fair và cs, 1995[62]; Otoi và cs, 1997[141]; Avery và cs, 2003[26]). Khi kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm và nuôi phôi đã ổn định và cho kết quả tốt thì việc đánh giá hiệu quả sản xuất phôi nang sau thụ tinh ống nghiệm đ−ợc dùng để đánh giá ng−ợc lại khả năng phát triển của trứng trong các nang đ−ợc xếp loại theo kích th−ớc (Madison và cs, 1992[119]; Pavlok và cs, 1992[149]; Lonergan và cs, 1994[112]; Blondin và cs, 1997[33]) hoặc một số tác giả đã nghiên cứu mối liên quan giữa tiềm năng phát triển của trứng (tạo phôi
dâu và phôi nang) đến giai đoạn động dục của bò cho trứng (Arlotto, 1996)[22], hoặc kích th−ớc của trứng (Otoi và cs, 1997)[141], vị trí thu trứng trên buồng trứng (Takagi và cs, 1992[168]; Hamano và cs, 1993[83]; Arlotto, 1996[22]) cũng nh− sự kết hợp của nhiều yếu tố này (Gordon, 1994[78]; Lonergan và cs, 2003[115]).
Hình thái của trứng là một đặc điểm ban đầu đáng l−u ý giúp chúng ta có thể nhanh chóng sơ bộ đánh giá tiềm năng phát triển của trứng về sau, nghĩa là có mối liên hệ chặt chẽ giữa chất l−ợng trứng với khả năng tạo phôi dâu và phôi nang sau thụ tinh ống nghiệm (Leibfried-Rutledge, 1986a)[107].
Trứng thu từ các nang ở các giai đoạn tạo nang khác nhau có khả năng phát triển và thành thục trong ống nghiệm là không khác nhau (Chian và cs, 2002)[47]. Thí nghiệm đ−ợc tiến hành trên 78 buồng trứng bò (Canada), mỗi nhóm thí nghiệm gồm 26 buồng trứng. Các buồng trứng đ−ợc phân lô tùy theo kích th−ớc nang định thu trứng cũng nh− sự hiện diện hay không của thể vàng. Nhóm 1 là nhóm có các nang đang ở pha sớm: tất cả các nang đều có đ−ờng kính nhỏ hơn hay bằng 8mm; nhóm 2 là nhóm có các nang đang ở pha muộn: tồn tại trên buồng trứng nang lớn nhất có đ−ờng kính bằng hoặc lớn hơn 15mm; nhóm 3 là nhóm đang ở pha thể vàng: tất cả các nang đều có đ−ờng kính nhỏ hơn hoặc bằng 8mm và có sự hiện diện của thể vàng trên buồng trứng. ở các nhóm thí nghiệm nói trên, tiến hành hút tất cả các nang và các trứng có chất l−ợng tốt đ−ợc nuôi trong 1 ml môi tr−ờng 199 có bổ sung 10% huyết thanh bò, 0,2mM pyruvate, 75mIU/ml FSH và LH (Humegon). Quá trình nuôi thành thục diễn ra trong tủ nuôi ở 38,50C; 5%CO2 trong 24 giờ. Sau khi thành thục, trứng đ−ợc thụ tinh ống nghiệm với tinh trùng đông lạnh, giải đông và sau đó tiếp tục nuôi phôi để đánh giá tỉ lệ phân chia, phôi dâu và phôi nang.
Kết quả chỉ ra rằng, số trứng thu từ buồng trứng có nang đang ở giai đoạn sớm trong nhóm 1 là cao hơn đáng kể so với các nhóm khác (P<0,05).
Nhóm 1 thu đ−ợc trung bình 32 + 8,1 trứng/buồng trứng và nhóm 2, 3 lần l−ợt là 20,1 + 5,4 và 22,7 + 6,9 trứng/buồng trứng.
Tỉ lệ trứng thành thục, phân chia và phát triển đến giai đoạn phôi nang là không khác nhau. Cụ thể ở nhóm 1, các tỉ lệ nói trên lần l−ợt là 84,4%; 53,5% và 27,4%. Đối với nhóm 2 thì các tỉ lệ trên lần l−ợt là 89,2%; 53,3% và 33%. Kết quả trên nhóm 3 là 83,6%; 51,3% và 30,4%.
Các kết quả trên chỉ ra rằng khả năng phát triển và thành thục của trứng thu từ các nang ở các giai đoạn phát triển khác nhau là không khác nhau.
Trứng sau khi đ−ợc hút ra khỏi nang đ−ợc phân loại và nuôi thành thục trong ống nghiệm, ở bò, thời gian nuôi để trứng có thể phát triển đến giai đoạn Metaphase II là dao động xung quanh 24 giờ.
Một công trình nghiên cứu của Nakagawa và cs (1995)[129] đã trình bày các giai đoạn thành thục nhân trứng và sự phát triển của hợp tử trong ống nghiệm. Các tác giả bố trí 4 lô thí nghiệm tùy thuộc vào thời gian nuôi thành thục trứng (14, 20, 24 và 28 giờ). Kết quả thu nhận nh− sau: tỉ lệ thành thục xác định bằng đánh giá trạng thái nhiễm sắc thể ở trạng thái Metaphase II lần l−ợt ở các lô là 0; 69,5; 76,1 và 81,7%; tỉ lệ phôi nang lần l−ợt là 21,2%; 36,6%; 46,8% và 32,5%.
Việc bổ sung Estradiol-17β vào môi tr−ờng nuôi thành thục trứng có tác dụng cải thiện hiệu quả nuôi thành thục trong ống nghiệm các trứng bò thu từ các nang có đ−ờng kính 1-6mm (Fukui và cs, 1982[70]; Younis và cs, 1989[180]; Beker và cs, 2002[31]). Tuy nhiên, nồng độ Estradiol-17β cao lại có ảnh h−ởng âm tính đến việc hình thành các thoi vô sắc cũng nh−
sự xuất hiện thể cực đầu tiên (Kruip và cs, 1988)[101].
Tóm lại, các trứng có chất l−ợng tốt thu từ buồng trứng đều ở trạng thái ch−a thành thục và hoàn toàn có thể nuôi thành thục trong các môi tr−ờng tổng hợp. Sự thành thục nhân, nguyên sinh chất, màng sáng có kèm theo những biến đổi và chuyển hóa cần thiết để trứng sẵn sàng tham gia vào quá trình thụ tinh tiếp theo. Chất l−ợng trứng, môi tr−ờng nuôi, điều kiện nuôi
... là các yếu tố có ảnh h−ởng trực tiếp đến kết quả nuôi thành thục ống nghiệm cũng nh− sự phát triển về sau của phôi ống nghiệm.