Bê thụ tinh ống nghiệm đầu tiên ra đời 1981 tại Mỹ (Brackett và cs, 1982)[36]. Đây là một bê đực có nguồn gốc từ một trứng đã thành thục
in vivo đợc thụ tinh in vitro với các tinh trùng tơi (đã xuất ra ngoài), hợp tử đợc cấy ngay vào vòi trứng của bò nhận. Sự ra đời của con bê này đánh dấu khả năng thành công đến cùng của kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm trên bò.
Hiệu quả sản xuất bê từ phơng pháp thụ tinh ống nghiệm trong giai đoạn này là thấp hơn nhiều so với tự nhiên, nhận xét này đợc thể hiện trong kết quả nghiên cứu của một số tác giả và đợc trình bày trong các bảng sau:
Bảng 1.7: Hiệu quả thụ tinh ống nghiệm các trứng bò thành thục in vivo.
Brackett và cs (1982[37], 1984[38]) Lambert và cs (1986[103]) Leibfried Rutledge và cs (1986a[107])
lực thụ tinh tinh trùng HIS HIS Heparin Trứng thành thục 67%* 43%* 78%** Thụ tinh ống nghiệm*** Nang 14% 41% 57% Vòi trứng 12% 32% Sự phát triển phôi**** 15-20% 45% Chửa 5/19 (21%) 6/13 (46%) 2/10 (20%) Bê con 3/19 (16%) 6/13 (46%) 0/10 (0%) Ghi chú:
* Trứng thu từ nang với sự tơi bông của lớp tế bào cumulus bao quanh ** Trứng thu từ vòi trứng
*** Trứng thu từ nang hoặc vòi trứng **** Trứng thu từ nang
Kết quả thụ tinh ống nghiệm với các trứng thành thục in vitro và
in vivo là khác nhau rất nhiều, kết quả nghiên cứu của Leibfried Rutledge và cs, (1986a)[107] đợc trình bày trong bảng 1.7 và 1.8 chứng minh rõ nhận định này.
Bảng 1.8: Hiệu quả thụ tinh ống nghiệm các trứng bò thành thục in vitro.
% trứng thành thục* Tinh trùng sử dụng % thụ tinh Ball và cs (1983)[28] >70 Mào tinh 70
Iritani và cs (1984)[94] 80 Tơi 44,63
Hensleigh và Hunter (1985)[89] 56 Tơi 15 Parrish và cs (1985a)[145] >70 Tơi 72
Fukui và cs (1983)[69] 64 Tơi 28
Parrish và cs (1986b)[148] >70 Tơi đông lạnh
81 Leibfried Rutledge và cs (1986a)[107] 70 Tơi 94**
73 đông lạnh 91
* Trứng thành thục với sự tơi bông của tế bào cumulus và/hoặc ở trạng thái Metaphase II.
** Trong quá trình thành thục có nuôi chung với tế bào granulose.
Bảng 1.9: Sự phát triển của phôi bò thụ tinh ống nghiệm từ các trứng thành thục in vitro hoặc in vivo trong ống dẫn trứng cừu (Leibfried Rutledge và cs, 1986a)[107]. Thụ tinh Phát triển Trứng thành thục Số trứng có tinh xâm nhập/tổng số trứng (%) Số trứng có hai tiền nhân/số trứng có tinh xâm nhập (%) Số trứng thụ tinh bình th- ờng/tổng số trứng sử dụng (%) Tỉ lệ phôi phân chia (%) Tỉ lệ phôi dâu hoặc phôi nang (%)
In vitro 158/207(76) 115/158(73) 80/207(39) 15/33(45) 0/33(0) In vivo Nang 22/24(96) 18/22(82) 19/24(80) 66/80(82) 36/80(45) Vòi trứng 24/28(86) 20/24(83) 15/24(53) 38/56(68) 14/56(25)
Qua những kết quả ở bảng 1.9, chúng ta thấy trứng thành thục in vitro có khả năng thụ tinh ống nghiệm và sự phát triển của phôi ống nghiệm về sau là kém hơn trứng thành thục in vivo.
Mặc dù phôi bò có thể phát triển đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang trong ống đẫn trứng của thỏ (Trouson và cs, 1977)[172] hoặc trong ống dẫn trứng của cừu (Willadsen và Polge, 1981[176]; Eyestone và cs, 1985[61]) nhng phơng pháp nuôi phôi in vivo này không thuận tiện trong việc mở rộng các nghiên cứu, vì vậy vấn đề môi trờng nuôi phôi in vitro trở nên cần thiết để góp phần đẩy nhanh hiệu quả của công nghệ thụ tinh ống nghiệm.
Thụ tinh ống nghiệm bò đặt ra những yêu cầu mà các nhà nghiên cứu cần quan tâm: 1) hệ thống thu trứng thích hợp để tránh làm hỏng trứng ngay từ đầu, 2) sự thành thục của nhân trứng, bào tơng và cả sự phát triển của lớp tế bào cumulus bao quanh trứng, 3) hệ thống nuôi in vitro hoàn hảo để trứng có thể tiếp tục phát triển đến giai đoạn thành thục và có chất lợng tốt, 4) hệ thống tăng cờng năng lực thụ tinh của tinh trùng thích hợp để tinh trùng có thể thực hiện việc thụ tinh in vitro với hiệu quả tốt và 5) hệ thống và điều kiện nuôi phôi hiệu quả để hoàn thành việc thụ tinh ống nghiệm, giúp phôi phát triển bình thờng trong ống nghiệm từ giai đoạn thụ tinh đến khi trở thành phôi nang đạt yêu cầu để cấy chuyển vào bò nhận.
Thành công của kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm gắn liền với hai thành tố quan trọng là trứng và tinh trùng. Để có thể thụ tinh đợc thì tinh trùng phải đợc kiện toàn năng lực thụ tinh và trứng cũng phải ở trạng thái thành thục. Hai vấn đề này càng có vai trò quan trọng và thể hiện rõ khi tiến hành thụ tinh in vitro.
Trong tự nhiên, hiện tợng thụ tinh xảy ra trong đờng sinh dục của bò ở 38-39oC và đối với kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm, ngời ta mô phỏng theo điều kiện này, nghĩa là tiến hành thụ tinh ống nghiệm ở nhiệt độ khống chế 39oC (Lenz và cs, 1983a)[108]. Nhiệt độ không chỉ ảnh hởng đến hiệu quả kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng mà còn ảnh hởng đến khả năng thực hiện phản ứng thể đỉnh của tinh trùng khi tơng tác với vùng sáng (zon pellucida) của tế bào trứng.
Trong tự nhiên, tinh trùng bò xuất hiện ở vùng eo của ống dẫn trứng của con cái khoảng 18-20 giờ sau khi bắt đầu đi vào đờng sinh dục con cái (Hunter và Wilmut, 1984)[92]. Quá trình di chuyển của tinh trùng trong đ- ờng sinh dục của con cái nh vậy, dới tác động của dịch tử cung và ống dẫn trứng đã giúp tinh trùng kiện toàn năng lực thụ tinh.
Trong in vivo, khi tiến hành khảo sát hàm lợng glycosaminoglycans trong đờng sinh dục bò cái, Lee và Ax, (1984)[105] nhận thấy trong dịch ống dẫn trứng có sự hiện diện với nồng độ cao của heparin. Trong in vitro, ngời ta nhận thấy glycosaminoglycan thúc đẩy phản ứng thể đỉnh hoặc có ảnh hởng đến sự kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng (Handrow và cs, 1982[86]; Ball và cs, 1983[28]; Parrish và cs, 1985a[145]).
Hiện nay, hầu hết các phòng thí nghiệm trên thế giới đều sử dụng chất heparin (với nồng độ dao động từ 1-20àg/ml) nh là một thành phần không thể thiếu trong quá trình kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng bò, kết quả thụ tinh ống nghiệm từ các tinh trùng này đạt từ 65-85% (Le Guienne và cs, 1988[183]; Lonergan và cs, 1999[114]; Mizushima và cs, 2000[124]; Bing và cs, 2003[32]).
Có một số chất khác, khi thêm vào môi trờng xử lý kiện toàn năng lực thụ tinh cũng dẫn tới hiệu quả tơng tự heparin. Hanada và cs, (1986)[84]; Palmer và cs, (1990)[184] khi tiến hành thụ tinh ống nghiệm ở bò, dê và ngựa đã xử lý kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng bằng cách thêm chất canxi ionophore A23187 vào môi trờng xử lý trong thời
gian ngắn. Goto và cs, (1988)[80] thêm chất caffein vào môi trờng BO trong thụ tinh ống nghiệm bò.
Trong khi hoàn thiện kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm ở bò, nhiều tác giả quan sát thấy có sự khác nhau về hiệu quả thụ tinh giữa tinh trùng của các đực giống khác nhau, thậm chí trên cùng đực giống nhng ở các lần lấy tinh khác nhau (Brackett và cs, 1982[36]; Sirard và cs, 1985[163], Parrish và cs, 1986b[148]). Sử dụng một phần nhỏ trong số tinh trùng xuất tinh của đực giống, ngời ta có thể dùng cho việc thụ tinh ống nghiệm và qua đó kiểm tra đợc khả năng thụ tinh của tinh trùng đực giống bằng cách cho thụ tinh với các trứng đã thành thục in vitro. Kết quả của Leibfried-Rutledge (1986a)[107] đã chứng tỏ hiệu quả thụ tinh ống nghiệm của những trứng thành thục in vitro cũng tơng đơng với trứng thành thục in vivo và điều này càng thuận lợi khi ngời ta có thể thu đợc nhiều buồng trứng có chất lợng tốt từ lò mổ.
Tuy nhiên, khác với phôi ngời và phôi thỏ, ở một số loài động vật khác, ngời ta quan sát thấy có hiện tợng “block (ngng trệ)” ở phôi nuôi in vitro. Cụ thể ở bò là ở giai đoạn 8-16 tế bào. Hiện tợng “ngng trệ” này có nguyên nhân từ sự lệch pha giữa sự sụt giảm ARNm có nguồn gốc từ tế bào trứng và sự khởi động quá trình phiên mã ARNm xuất phát từ bộ gen của phôi. Trong nuôi phôi in vitro, điều này có nguyên nhân trực tiếp từ môi tr- ờng nuôi phôi, nghĩa là các điều kiện của môi trờng trong những trờng hợp cụ thể, không đáp ứng đầy đủ và kịp thời cho tất cả các phản ứng sinh lý và sinh hoá xảy ra trong quá trình phát triển của phôi (Camous và cs, 1984[42]; Eyestone và First, 1986[59]; Heyman và cs, 1987[90]; Thibault, và cs 1993 [170]).
Để giúp phôi thụ tinh ống nghiệm có thể vợt qua đợc giai đoạn “ng- ng trệ” này, ngời ta nghĩ đến việc sử dụng tế bào ống dẫn trứng nh một tác nhân bổ trợ quan trọng trong môi trờng nuôi phôi ống nghiệm.
Hiệu quả của việc bổ sung tế bào ống dẫn trứng đợc nhiều tác giả chứng minh. Eyestone và First, (1989)[60] đã dùng tế bào ống dẫn trứng bổ
sung vào môi trờng nuôi phôi bò khai thác in vivo giai đoạn sớm (1-8 tế bào) và thu đợc kết quả số phôi vợt qua đợc giai đoạn 16 tế bào /tổng số phôi phân chia là 63% so với lô đối chứng (M199, FCS) là 5%; tỉ lệ phôi dâu và phôi nang trong môi trờng có bổ sung tế bào ống dẫn trứng cũng cao hơn nhiều là 43% so với lô đối chứng chỉ đạt 3%. Kết quả với thí nghiệm trên phôi thụ tinh ống nghiệm từ các trứng thành thục in vitro cũng cho kết quả cao hơn ở lô có bổ sung tế bào ống dẫn trứng. Với lô có bổ sung tế bào, tỉ lệ phôi vợt qua giai đoạn 16 tế bào là 35%, tỉ lệ phôi dâu và phôi nang đạt đợc là 22%; với lô đối chứng các tỉ lệ này lần lợt là 7% và 3%.
Năm 1987, đôi bê thụ tinh ống nghiệm đầu tiên của thế giới ra đời từ một chuỗi liên hoàn các công nghệ in vitro trong phòng thí nghiệm (nuôi trứng thành thục trong ống nghiệm, thụ tinh ống nghiệm, nuôi phôi trong ống nghiệm, kết quả này đợc công bố tại Ireland (Lu và cs, 1987[118]; 1988[117]). Liên tục những năm sau đó, các nghiên cứu cải tiến quy trình nuôi trứng thành thục, thụ tinh ống nghiệm và nuôi phôi cũng đợc xúc tiến mạnh mẽ.
Ngoài việc nuôi chung (co-culture) phôi với tế bào ống dẫn trứng, các phòng thí nghiệm còn nuôi chung phôi với các loại tế bào khác nh tế bào MDBK (madin darby bovine kidney), BRL (buffalo rat liver), Vero (cellules de rein de singe vert) hoặc các loại tế bào ống dẫn trứng, tế bào cumulus, tế bào granulose... (Aoyagi và cs, 1990[21]; Fukui và cs, 1991[71]; Carolan và cs, 1995[43]; Donnay và cs, 1997[53]; Lima cs, 2004[110]).
Tuy nhiên, việc nuôi chung phôi với các loại tế bào sinh dỡng nh vậy cũng dẫn tới nguy cơ lây nhiễm các loại bệnh là cao hơn (Avery và cs, 1993[26]; Springfellow và cs, 1995[166]).
Nhằm phòng tránh các nguy cơ về lây bệnh cũng nh giảm bớt các công đoạn chuẩn bị môi trờng và các loại tế bào sinh dỡng phục vụ việc nuôi phôi thụ tinh ống nghiệm, ngời ta tiến hành cải tiến pha chế các loại
môi trờng tổng hợp có thành phần cơ bản gần giống với các loại dịch trong ống dẫn trứng và gọi đây là môi trờng “dịch ống dẫn trứng tổng hợp” (synthetic oviduct fluid) (Tervit và cs, 1972)[169]. Loại môi trờng này đảm bảo để phôi phát triển in vitro bình thờng với sự thêm vào đó một số chất nh BSA, huyết thanh bò động dục, huyết thanh bào thai bê, EGF, citrat, myo-inositol.... (Holm và cs, 1999[91]). Tỉ lệ phôi phân chia trong thí nghiệm của Holm đạt từ 77-79% và tỉ lệ phôi nang đạt từ 19-47%.
Trong quá trình thực hiện thụ tinh ống nghiệm ở bò, ngời ta nhận thấy hiệu quả thâm nhập của tinh trùng vào trứng là khác nhau đối với các đực giống khác nhau. Ohgodavà cs (1988)[137] đã thực hiện thí nghiệm thụ tinh ống nghiệm bằng tinh trùng của 6 đực giống khác nhau. Sau thời gian thụ tinh kéo dài 20-24 giờ, các trứng đợc cố định ở nhiệt độ phòng trong 25% (v/v) axít acetic:cồn và nhuộm bằng thuốc nhuộm Orcein 1% (w/v) trong 45%(v/v) axít acetic. Tỉ lệ các trứng với sự có mặt của nhân tinh trùng trong bào tơng đợc ghi nhận để đánh giá hiệu quả xâm nhập của tinh trùng vào trứng đợc ghi nhận. Kết quả cho thấy tỉ lệ xâm nhập của tinh trùng vào trứng rất khác nhau giữa 6 đực giống này: tỉ lệ này cao nhất ở đực giống có ký hiệu P-157(83%), cao hơn rất nhiều (P<0,001) so với những đực giống còn lại (dao động từ 0% đến 25%). Không có sự khác nhau về tỉ lệ này giữa các đực giống P-158 (25%), P-159 (12%), P-160- 24% và P-161(13%). Riêng đực giống P-162 thì hoàn toàn không thấy có tinh trùng xâm nhập đợc vào trứng.
Hiện tợng trên cũng đợc Parrish và cs, (1986b)[148] quan sát thấy khi thực hiện thụ tinh ống nghiệm bằng các tinh trùng đông lạnh-giải đông. Tuy nhiên, bản chất của hiện tợng này còn cha đợc giải thích.
Chất lợng trứng đa vào thụ tinh ống nghiệm cũng là một yếu tố ảnh hởng trực tiếp đến kết quả thụ tinh (Leibfried và First, 1979[106]; Shioya và cs, 1988[161]). Trong thí nghiệm của mình, Shioya thu trứng từ buồng trứng của bò sữa và chia ra 3 loại A, B và C dựa trên hình thái lớp tế bào cumulus bao quanh. Loại A là những trứng đợc bao bọc bởi nhiều lớp dày
đặc tế bào cumulus, loại B là những trứng cũng đợc bao bọc bởi những lớp tế bào cumulus xung quanh nhng các lớp này không dày đặc hoặc có thể bị trần một phần, loại C là loại trứng hoàn toàn không có lớp tế bào cumulus bao quanh. Sau khi đợc nuôi thành thục và thụ tinh ống nghiệm, tỉ lệ phôi phân chia cho thấy: đối với các trứng có chất lợng A, tỉ lệ phôi phân chia đạt 63,7%), cao hơn rõ rệt (P<0,01) so với kết quả thu nhận từ lô trứng loại B (29,5%), riêng với lô trứng loại C thì tỉ lệ này rất thấp, chỉ 17,7%. Điều này cho chúng ta một chỉ dẫn rằng chỉ nên sử dụng các trứng có chất lợng A trong các nghiên cứu cải tiến, so sánh, đánh giá các phơng pháp, yếu tố ảnh hởng... trong thụ tinh ống nghiệm.
Một yếu tố quan trọng ảnh hởng đến kết quả thu nhận phôi dâu và phôi nang sau khi thụ tinh ống nghiệm ở bò là phơng pháp nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm trớc đó. Môi trờng phổ biến dùng trong nuôi thành thục trứng bò in-vitro là môi trờng 199. Việc bổ sung FSH, LH, E có ảnh h- ởng dơng tính lên khả năng thành thục và phát triển về sau của phôi ống nghiệm.
Trong một nghiên cứu của Baranao và Salamone, (1995)[29], nồng độ FSH bổ sung có tác động đến tỉ lệ phôi phân chia và phôi nang trong thụ tinh ống nghiệm bò. Các tác giả sử dụng FSH với liều lợng nh sau: lô đối chứng, không có FSH, lô thí nghiệm đợc bổ sung FSH với nồng độ lần lợt là 20ng/ml; 200ng/ml và 2000ng/ml. Kết quả ở lô đối chứng: tỉ lệ phôi phân chia đạt 55,8%, tỉ lệ phôi nang đạt 11,7%; lô thí nghiệm: với nồng độ 200ng/ml FSH, các tỉ lệ trên lần lợt là 74,6% và 22.3%. Đối với nồng độ FSH thấp (20ng/ml) hoặc quá cao (2000ng/ml) thì tỉ lệ phôi phân chia có cao hơn lô đối chứng nhng tỉ lệ phôi nang không khác về mặt thống kê. Điều này chứng tỏ việc bổ sung FSH là cần thiết nhng việc lựa chọn nồng độ thích hợp là quan trọng.
Giai đoạn xử lý tinh trùng và thụ tinh ống nghiệm cũng ảnh hởng đến kết quả thu nhận phôi nang. Nh đã trình bày trong phần phơng pháp xử lý tinh trùng dùng trong thụ tinh ống nghiệm, hai phơng pháp lọc qua phân
lớp percoll và bơi ngợc (swim-up) hay đợc các phòng thí nghiệm dùng phổ biến trong việc kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng. Tuy nhiên đối với phơng pháp lọc qua phân lớp percoll, trớc khi cho tinh trùng vào môi tr- ờng thụ tinh cùng với trứng, phải loại bỏ phần percoll này càng sạch càng tốt. Sự có mặt của percoll trong môi trờng thụ tinh làm ảnh hởng đến tỉ lệ thụ tinh và thu nhận phôi nang (Keefer và Paprocki, 1995)[98]. Khi nồng độ percoll là 50% trong môi trờng thụ tinh thì tỉ lệ phôi phân chia là 23%, tỉ lệ phôi nang là 4%; so với lô không có percoll (đã rửa sạch) thì các tỉ lệ trên lần lợt là 51% và 18%.
Thành phần khí nuôi dùng trong nuôi phôi thụ tinh ống nghiệm cũng là một yếu tố có ảnh hởng đến tỉ lệ phôi nang thu đợc về sau. Cụ thể ở đây là nồng độ oxy trong tủ nuôi. Nồng độ oxy đợc đánh giá là có ảnh hởng