C 6H3(OH)(SO3H) 2+ HNO3 → 6H2OH(NO3) 3+ H2SO 4+ H2O Triazotedfenol
3.3.2.3.Ph−ơng pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
* Chuẩn bị tăng sinh và pha loãng
- Với những mẫu rắn thì cần đ−ợc nghiền ra và đem hoà tan với n−ớc cất vô trùng hoặc n−ớc muối sinh lý.
- Với những mẫu −ớc đoán ít vi sinh vật sẽ đ−ợc nuôi tăng sinh.
- Với những mẫu −ớc đoán nhiều vi sinh vật sẽ đ−ợc pha loãng để nuôi cấy.
* Ph−ơng pháp nuôi cấy
- Nuôi cấy phân lập: dùng que cấy vô trùng thu mẫu vi khuẩn từ các tổ chức, cấy lên men tr−ờng BHIA hoặc NA hoặc TSA để ở tủ ấm, sau 24 giờ đọc kết quả. Chọn những khuẩn lạc rời, có hình thái, màu sắc, kích th−ớc… khác nhau để định loại vi khuẩn.
- Nuôi cấy thuần: dùng que cấy vô trùng chuyển khuẩn lạc đã chọn từ đĩa nuôi cấy ban đầu, mỗi loại sang một ống nghiệm chứa môi tr−ờng BHIA
hay NA (nghiêng) ở nhiệt độ 250C, sau 18 - 24 giờ lấy vi khuẩn nhuộm Gram và thử các phản ứng sinh hoá.
* Ph−ơng pháp phân lập vi khuẩn
- Nhuộm Gram xác định hình thái kích th−ớc bắt màu của vi khuẩn, làm tiêu bản giọt treo để kiểm tra khả năng di động của vi khuẩn đây là những b−ớc đầu tiên để phân lập các nhóm vi khuẩn.
- Phản ứng Cytocrom để phân biệt giữa hai họ Entevobacteriaceae và
Vibrionaceae.
- Các phản ứng catalaza, OF… là những b−ớc tiếp theo để xác định tên họ, giống vi khuẩn.
Dựa vào kết quả phân lập đ−ợc, kết hợp với bảng phân loại của S.D.Smilla và G.N.Frerichs (Stirling, 1984) [45], hệ thống phân loại của Bergey (1974), quy trình chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh cho cá (FHS, 1974) để định loại vi khuẩn.
(Tóm tắt quá trình nuôi cấy và phân lập vi khuẩn đ−ợc mô tả ở sơ đồ 3.1)
Hình 3.1. Sơ đồ phân lập vi khuẩn
Mẫu cá
Thu mẫu tổ chức
Cấy trên môi tr−ờng cơ bản
Chọn khuẩn lạc
Nuôi cấy thuần
Nhuộm Gram
Phân loại vi khuẩn
Thử các phản ứng sinh hoá Làm tiêu bản giọt treo