Trong tự nhiên, hầu hết VSV sinh trưởng trong môi trường có chứa nhiều loại VSV khác nhau. Việc nuôi cấy hỗn hợp ít được sử dụng trong nghiên cứu VSV bởi vì khó khăn trong việc xác định riêng rẽ từng loại vì khi đó chúng cùng các vi sinh vật khác cùng biểu lộ các hoạt tính. Nuôi cấy thuần khiết, chỉ chứa một loại VSV đơn là yêu cầu trong các khái niệm nghiên cứu như đặc tính, bệnh phát sinh, trao đổi chất và khả năng kháng kháng sinh…
Trong những năm 1970, Joseph Lister đã đặt vấn đề nuôi cấy thuần khiết
bằng cách tiến hành dãy pha loãng tới khi mỗi một ô về mặt lý thuyết chỉ chứa một vi khuẩn. Tuy nhiên, sự thành công là rất giới hạn và sự tạp nhiễm (có mặt các VSV không mong muốn) rất phổ biến. Năm 1980, Robert Koch đặt nền móng cho môi trường đặc, nhờ đó các nhà VSV học có thể tách rời VSV bằng pha loãng và thu nhận chúng trên môi trường đặc. Một vi khuẩn được phát hiện dựa trên sự hình thành khuẩn lạc có thể nhìn thấy được chỉ chứa một loại VSV.
Hiện nay có 3 phương pháp nuôi cấy thường được sử dụng để phân lập
VSV: ria đĩa, gạt đĩa và đổ đĩa. Trong kỹ thuật ria đĩa, một que cấy tròn được sử dụng để tạo vệt mẫu trộn nhiều lần trên bề mặt của môi trường nuôi cấy rắn trong đĩa Petri. Về mặt lý thuyết, dùng que cấy tròn tạo vệt nhắc lại cho bề mặt thạch, VSV lần lượt rơi khỏi que cấy được phân bố đồng đều trên mặt thạch, mỗi tế bào sẽ phát triển thành một khuẩn lạc. Cấy ria đĩa là một kĩ thuật phân lập đang được sử dụng ngày nay.
Cấy gạt và đổ đĩa là kỹ thuật định lượng cho phép xác định số lượng VSV trong một mẫu cơ chất. Trong kỹ thuật gạt đĩa, một số lượng nhỏ mẫu pha loãng xác định được gạt trên đĩa môi trường đặc bằng cách sử dụng một que uốn cong (hình dạng giống như một chiếc gậy hockey). Trong kỹ thuật đổ đĩa, một lượng nhỏ mẫu pha loãng được trộn với thạch nóng chảy và đổ trực tiếp vào đĩa Petri vô trùng còn rỗng. Sau khi nuôi, VSV sinh trưởng có thể nhìn thấy là các khuẩn
lạc trên hoặc trong đĩa thạch đã đổ. Để xác định số lượng VSV trong một mẫu ban đầu, các đĩa với số khuẩn lạc từ 25-250 được lựa chọn. ít hơn 25 khuẩn lạc là không đúng bởi vì một sự tạp nhiễm đơn gây ra ít nhất 4% sai số. Một đĩa có lớn hơn 250 khuẩn lạc thì khó đếm. Số lượng VSV trong mẫu ban đầu được tính theo phương trình sau:
Số lượng khuẩn lạc
VSV/ml =
độ pha loãng
1. Vật liệu
Đĩa Petri chứa môi trường thạch Ống nghiệm chứa thạch nóng chảy Đĩa Petri vô trùng, bình nón 250 ml Pipet 1 ml vô trùng, pipet bóp bóng
Môi trường thạch nghiêng
Dịch nuôi cấy: 2 loại vi khuẩn
2. Thủ tục tiến hành
a. Dán nhãn vào đáy của 2 đĩa môi trường tương ứng với 2 loại dịch nuôi cấy. b. Khử trùng que cấy: hơ nóng đỏ đầu que cấy, làm nguội rồi lấy vô trùng một vòng que cấy dịch VSV
c. Thao tác tạo vết cấy có thể thực hiện với các đĩa Petri đặt trên bàn hoặc trên tay.
- Nhấc một mép của đĩa petri lên và cấy ở phần đầu tiên bằng cách tạo các đường không chồng nhau (đường rích rắc). Không được làm xước mặt thạch trong khi cấy.
- Khử trùng que cấy, quay đĩa tiếp và ria qua một khu vực của phần thứ
hai sang phần thứ ba hoặc ria trên phần còn lại của bề mặt thạch, cần cẩn thận tránh tạo các đường chạm vào các phần cấy trước đó.
- Khử trùng que cấy trước khi cắm lại vào giá đựng.
d. Có thể ria cấy trên nhiều đĩa với một vài loại dịch VSV. Sau đó dán nhãn, ghi tên người thực hiện, ngày và nguồn dịch nuôi cấy.
e. Nuôi các đĩa vừa cấy ở 30- 35oC trong tủ định ôn cho tới khi phát hiện các khuẩn lạc riêng rẽ phát triển (thường từ 24-48 h). Chú ý khi đặt các đĩa Petri trong tủ phải để ngược lại cho phần nắp đĩa xuống phía dưới.
g. Sau khi nuôi cấy, ghi lại kết quả
h. Tiếp tục cấy chuyền từ một khuẩn lạc đơn dòng sang đĩa môi trường
mới nhiều lần cho đến khi thu được giống thuần khiết. Sau đó cấy từ một khuẩn lạc trên đĩa đã thuần vào ống môi trường thạch nghiêng để giữ giống.