Xellulo, một hợp chất hữu cơ quan trọng nhất trong tự nhiên được quan
tâm rất nhiều. Thực vật có chứa 4-70% xellulo. Sự phân giải xellulo bởi VSV sử dụng ít nhất 3 hệ thống enzym khác nhau (enzym nội bào β1-4- glucanaza, enzym ngoại bào β1-4- glucanaza, β1-4- glucosidaza). Nấm (ví dụ Chaetomium,
Fusarium, Polyporaceae, Poriaceae), vi khuẩn (Pseudomonas,…), xạ khuẩn
(Actinomycetes…) là các loài hảo khí phân giải xellulo quan trọng nhất. Trong điều kiện yếm khí, xelluloza bị thuỷ phân bởi vi khuẩn thuộc giống
Clostridium. Sự phân giải của xelluloza ngoại bào kết thúc với xellobioza.
Trong enzym đất, việc xác định hoạt động của xellulaza từ xellulo tự
nhiên không hoà tan trong nước là rất khó. Cacboxy methyl xelluloza (CM- xelluloza) xử lý trước đó vì thế thường được sử dụng. Giống như xác định hoạt tính của xylanaza và invertaza, hoạt tính xellulaza được xác định từ các đường được giải phóng.
Sử dụng CM-xelluloza là chất nền, mẫu đất được ủ ở 50oC/24h và pH=5,5. Việc giảm lượng đường được giải phóng ra trong quá trình ủ gây ra sự
biến đổi Kali hexacyanoferrate (III) trong dung dịch kiềm. Kali
hexacyanoferrate (II) phản ứng với ferric (NH4)2SO4 trong dung dịch axit tạo thành phức hợp feric hexacyanoferrate (II) (phổ màu xanh) được xác định bằng máy so màu (theo Schinner và von Mersi, 1990).
1. Vật liệu, hoá chất
- Đệm axetat 2M, pH=5,5: Hoà tan 164,06g CH3COONa khan/l, pha loãng 60ml axit axetic đóng băng trong 500 ml. Trộn 1000 ml CH3COONa với 190ml axit axetic pha loãng, điều chỉnh đến pH = 5,5.
- Dung dịch nền (0,7% theo khối lượng): 7g CMC-Na/1000ml đệm axetat,
khuấy trên máy khuấy từ ở 45oC/2h.
- Thuốc thử A: 16g Na2CO3 và 0,9g KCN/1000ml.
- Thuốc thử B: 0,5g Kali hexacyanoferrate (III)/1000ml, giữ trong lọ tối màu. - Thuốc thử C: 1,5g ferric amonium sulfat + 1g Natri dodecyl sulfat trong 900ml nước cất, thêm 4,2ml H2SO4 đặc, hoà tan ở 50oC. Sau khi làm nguội, lên thể tích đến 1000 ml.
- Dung dịch tiêu chuẩn đậm đặc (250 àg glucoza/ml): 0,25g glucoza
khan/1000ml
- Dung dịch tiêu chuẩn làm việc (25 àg glucoza/ml): 10 ml dung dịch tiêu chuẩn mẹ/100 ml.
2. Thủ tục tiến hành
- Cân 10g đất ẩm vào 3 bình nón 100ml. Thêm 15ml dung dịch chất nền và 15 ml đệm axetat vào 2 bình (mẫu), cho 15ml đệm axetat vào bình còn lại (đối chứng). Lắc nhẹ các bình, đánh dấu, đậy nút và ủ ở 50oC/24h.
- Sau khi ủ, nhỏ 15ml huyễn dịch chất nền vào bình đối chứng, lắc nhẹ, lọc các bình mẫu và đối chứng ngay. Pha loãng 0,5ml dịch lọc tới 20ml trong ống nghiệm.
- Để so màu, nhỏ 1ml dịch nền, 1ml thuốc thử A và 1ml thuốc thử B vào ống nghiệm, đánh dấu, trộn đều và ủ 15 phút trong chậu nước sôi.
- Sau khi làm nguội trong chậu nước ở nhiệt độ phòng 5 phút, thêm 5ml thuốc thử C, trộn và để lắng 60 phút ở nhiệt độ phòng cho phát triển màu. Trong vòng sau 30 phút, đo ở 690 nm trên máy quang phổ hấp phụ dựa vào phản ứng đối chứng trắng.
- Để chuẩn bị đường cong hiệu giá chuẩn, hút 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 và 0,6 ml dung dịch làm việc tiêu chuẩn vào 7 ống thử và pha loãng đến 1ml bằng nước cất. Xử lý các dung dịch này giống như lọc đất. Các dung dịch chuẩn hiệu chỉnh chứa 0; 2,5; 5,0; 7,5; 10; 12,5 và 15 àg glucoza.
3. Tính kết quả
Hoạt tính CM-xellulaza được chỉ ra là tương đương àg glucoza trên 1g vật chất khô và thời gian ủ. Lượng glucoza được tính từ đường cong chuẩn.
(S-C).30.40.100
= μg GE.g-1 dm.24h-1 10.% dm
S: Giá trị đo mẫu (μg GE)
C: Đối chứng (μg GE) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
30: Lượng hỗn hợp ủ (ml)
40: Hệ số pha loãng dịch lọc (ml)
10: Lượng đất ban đầu (g)
100%-1dm: Hệ số đất khô