II. CHUẨN BỊ CÁC MÔI TRƯỜNG ĐỂ NUÔI CẤY VI SINH VẬT
4.Chuẩn bị môi trường
Cần đọc kỹ công thức cấu tạo môi trường, chuẩn bị các hoá chất và dụng cụ liên quan
4.1. Pha chế
Nhìn vào các công thức môi trường, lần lượt cân đong các thành phần. Đánh dấu vào công thức các thành phần đã cân hoặc đong. Nếu công thức có thạch thì nên đong nước cho vào nồi đựng, cân thạch cho vào nước để thạch ngấm dễ tan khi được đun sôi và lần lượt cân đong các thành phần khác.
Nếu môi trường phải đun nấu, ngoài thể tích nước theo công thức nên bổ sung một lượng nhỏ nước để bù lại thể tích bay hơi khi đun (khoảng 15-20ml/l)
Mỗi hoá chất xúc bằng một thìa riêng khi cân. Cho hoá chất hoặc các thành phần được cân lên đĩa có giấy cân một cách từ từ tới khi vừa đủ. Nắm vững cách sử dụng các loại cân.
Với các thành phần có hàm lượng nhỏ nên pha dung dịch mẹ (stock solution), tính hàm lượng có trong 1 đơn vị thể tích suy ra thể tích cần lấy để bổ sung vào môi trường.
Các loại bột gạo, ngô, cám được cân và cho vào nước lạnh, vừa đun vừa
khuấy cho tới khi bột chín.
Các thành phần kém bền nhiệt như chất kháng sinh, vitamin…phải được khử trùng theo phương pháp riêng (thường sử dụng màng lọc khuẩn)
Đôi khi một số thành phần được cân riêng, khử trùng riêng và chỉ được trộn lại với nhau sau khi đã khử trùng để tránh phản ứng tạo thành kết tủa khi toàn bộ thành phần được khử trùng chung (xảy ra khi có mặt đồng thời các muối phôtphat và MgSO4).
4.2. Đun môi trường
Môi trường dịch thể: Nếu các thành phần tan đều trong nước thì không
cần đun.
Môi trường đặc: Đặt nồi lên bếp vừa đun vừa khuấy đều bằng đũa thuỷ tinh. Khi môi trường sôi một lúc, thạch tan hết là được, tránh đun lâu nước bay hơi sẽ làm cạn môi trường. Hớt bọt hoặc lọc trong nếu cần.
4.3. Điều chỉnh pH
Nếu môi trường ở dạng dịch thể trong suốt, không màu không chứa các chất dính nhớt như tinh bột, có thể đo pH bằng máy đo.
Môi trường có màu, chứa các chất dính nhớt không được đo pH bằng máy
(điện cực dễ bị hỏng), nên sử dụng giấy đo pH. Cũng có thể nhận biết pH qua màu sắc của môi trường do các chất chỉ thị màu tạo nên.
Nhìn chung, nếu các thành phần môi trường được cân đong chính xác, các hoá chất đạt tiêu chuẩn, sau khi pha chế môi trường sẽ đạt được giá trị pH cần có. Nếu pH sai lệnh quá lớn cần xem lại các khâu và phải pha lại môi trường. Nếu sai khác không lớn, có thể điều chỉnh bằng dung dịch kiềm (KOH, NaOH) hoặc axit (HCl,CH3COOH) loãng hoặc các muối theo chỉ dẫn ở công thức. Việc điều chỉnh pH cần thận trọng để sau khi chỉnh xong thể tích môi trường không bị thay đổi ngoài phạm vi cho phép.
* Lưu ý: Khi pH môi trường thấp hơn 6,0 - 6,5 thì sẽ xảy ta việc pepton hoá gelatin và sau khi khử trùng, môi trường sẽ không đông lại được. Khi pH thấp hơn 5,0 sẽ xảy ra sự thuỷ phân và thạch mất khả năng tạo gel.
Nếu môi trường có phản ứng kiềm thì khi khử trùng sẽ xuất hiện kết tủa sắt, xuất hiện việc caramen hoá đường và đường trở nên không hấp thu được đối với vi sinh vật. Để tránh những hiện tượng này, các môi trường được dùng để nuôi cấy các vi sinh vật ưa axit hoặc ưa kiềm phải được tiến hành khử trùng ở pH trung tính và sau khi hấp áp lực mới axit hoá hoặc kiềm hoá môi trường. Ngoài ra có nhiều thành phần của môi trường thường được khử trùng riêng ở những chế độ pH không ảnh hưởng tới chúng, sau đó mới đưa vào môi trường một cách vô trùng với số lượng thích hợp.
Sau khi khử trùng, pH môi trường có thể bị thay đổi đôi khi phải kiểm tra lại.
4.4. Phân phối môi trường vào các dụng cụ
Dụng cụ được dùng phải vô trùng. Để khử trùng tốt, môi trường chỉ được rót tới 1/2 dung tích của vật chứa. Với các ống nghiệm làm thạch nghiêng chỉ rót khoảng 1/4 chiều cao ống và 1/2 với ống làm thạch đứng.
Lớp môi trường càng dầy việc tiệt trùng càng khó, hơn nữa ở áp lực cao môi trường sẽ sôi mạnh làm đẩy nút và phụt ra ngoài.
Đối với các bình dùng để nuôi VSV hiếu khí trên máy lắc chỉ rót khoảng 1/5 dung tích bình. Đối với bình dùng nuôi kị khí, sau khi khử trùng dồn một số bình lại với nhau trong điều kiện vô trùng để đạt được thể tích cần thiết.