III. MÔI TRƯỜNG CHUYÊN TÍNH
1. Trao đổi Cacbon
Các phản ứng hoá học giải phóng ra năng lượng từ sự phân giải các phân tử hữu cơ phức tạp được gọi là dị hoá. Hầu hết VSV chuyển hoá hydratcacbon giải phóng CO2 và năng lượng. Hydratcacbon là các phân tử hữu cơ có chứa cacbon, hydro và oxy theo tỉ lệ (CH2O)n. Hydratcacbon có thể chia thành 3 nhóm dựa vào số lượng: monosaccharit, disaccharit và polysaccharit. Monosaccharit là loại đường đơn có chứa từ 3-7 nguyên tử cacbon, disaccharit
được tạo nên từ 2 đơn phân tử monosaccharit, và polysaccharit bao gồm 8 hoặc nhiều hơn các phân tử monosaccharit.
Enzim ngoại bào là enzim thuỷ phân chính bên ngoài tế bào, và phá vỡ
các vật chất lớn khi có thêm nước thành các thành phần nhỏ hơn mà chúng có thể chuyển vận vào trong tế bào. Enzim ngoại bào Amilaza thuỷ phân polysaccharit, tinh bột thành các hydratcacbon nhỏ hơn. Glucoza, một loại monosaccharit có thể được tạo ra do thủy phân. Trong phòng thí nghiệm, sự có mặt của các enzim ngoại bào được xác định bằng cách quan sát sự thay đổi cơ chất bên ngoài khuẩn lạc vi sinh vật.
Glucoza có thể vào bên trong tế bào và được dị hoá; một số vi khuẩn dị
hoá oxy hoá glucoza tạo thành oxit cacbon và nước. Dị hoá oxi hoá đòi hỏi phải có mặt phân tử oxy (O2). Tuy nhiên, hầu hết vi khuẩn lên men glucoza mà không sử dụng oxy. Dị hoá lên men không yêu cầu oxy nhưng có thể xảy ra trong điều kiện có oxy. Sản phẩm trao đổi chất cuối cùng của quá trình lên men là các phân tử hữu cơ nhỏ, thường là các axit hữu cơ. Một số vi khuẩn vừa oxy hoá vừa lên men, một số khác không thực hiện cả oxy hoá và lên men nhưng lại lấy cacbon và năng lượng từ các phương thức khác.
Một sinh vật bị oxy hoá hoặc lên men có thể được xác định bằng cách sử dụng môi trường cơ bản OF của Rudolph Hugh và Einar Leifson với loại
hydratcacbon mong muốn được thêm vào. Môi trường OF là môi trường dinh
dưỡng thạch sâu bán rắn chứa nồng độ hydratcacbon cao và nồng độ pepton
thấp. Pepton sẽ hỗ trợ một phần sự sinh trưởng của các vi khuẩn không oxy hoá và không lên men. Hai ống nghiệm được sử dụng: một ống mở để lấy không khí
và một ống bịt kín để giữ không có oxy. Môi trường OF chứa chỉ thị xanh
bromthymol, sẽ trở thành màu vàng khi có mặt axit, chứng tỏ xảy ra dị hoá cacbon. Trong điều kiện có alkan, sẽ sử dụng pepton và không dùng hydratcacbon được biểu lộ bằng màu xanh sẫm. Nếu hydratcacbon được chuyển hoá trong cả 2 ống, sự lên men đã xảy ra. Một số vi khuẩn sinh ra khí trong quá trình lên men các hydratcacbon. Một cơ thể chỉ sử dụng oxy hoá hydratcacbon sẽ chỉ sinh ra axit trong ống nghiệm mở. Môi trường OF được sử dụng để xác định sự dị hoá cacbon của vi khuẩn Gram âm Bacillus. Sự dị hoá cacbon sẽ được chứng minh trong bài tập này. Các test thử sẽ rất quan trọng trong việc xác định vi khuẩn.
1.1. Vật liệu
Đĩa Petri chứa môi trường dinh dưỡng thạch - tinh bột
Môi trường thạch sâu gluco-OF
Dầu khoáng
Thuốc nhuộm Gram
1.2. Dịch nuôi cấy
Bacillus subtilis Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
1.3. Thủ tục kỹ thuật yêu cầu 1.3.1. Thuỷ phân tinh bột 1.3.1. Thuỷ phân tinh bột
a. Đeo khẩu trang, chia môi trường thạch-tinh bột thành 3 phần bằng cách đánh dấu dưới đáy đĩa.
b. Cấy ria một đường đơn vi khuẩn Bacillus, Escherichia, Pseudomonas trên mỗi phần.
c. Đặt ngược các đĩa nuôi ở 35oC/24h. Sau khi sự sinh trưởng diễn ra, các đĩa có thể được cất trữ trong tủ lạnh ở 5oC tới giai đoạn thí nghiệm tiếp theo.
d. Ghi lại bất kỳ sự phát triển nào của vi sinh vật, sau đó đổ tràn Indon Gram lên đĩa. Khu vực thuỷ phân tinh bột sẽ hiện rõ, trong khi khu vực tinh bột không chuyển hoá sẽ nhuộm màu xanh sẫm.
1.3.2. Môi trường OF
a. Sử dụng que cấy thẳng, nhiễm 2 ống môi trường glucoza-OF với dịch nuôi cấy vi khuẩn đã chỉ định (Escherichia, Pseudomonas hoặc Alcaligenes).
b. Nhỏ khoảng 5ml dịch dầu khoáng trên 1 ống môi trường. Đậy nút lại. c. Nuôi tất cả các ống ở 35oC cho tới giai đoạn thí nghiệm tiếp theo.
d. So sánh các ống môi trường nhiễm và không nhiễm VSV. Ghi lại kết quả như sau: khuẩn lạc có mọc hay không, liệu glucoza đã được sử dụng? Và loại trao đổi chất?
Sự di động của vi khuẩn có thể xác định từ các ống môi trường OF.
e. Quan sát và ghi lại kết quả các loại VSV mà bạn không nuôi cấy (nhìn màu sắc đĩa nuôi cấy).