III. MÔI TRƯỜNG CHUYÊN TÍNH
1.Cácb ước phân tích
1.1 Dụng cụ phân tích:
- Bình tam giác, bình cầu, ống nghiệm (dung tích: 10ml, 100ml, 250 ml), Pipét chia độ 0,1 - 1,0 ml, 2ml, 5 ml, 10 ml), hộp nhôm, que cấy, que gạt, bi thủy tinh, giấy quỳ, khay men, cuốc, khoan ….Tất cả các dụng cụ đều phải tiệt trùng.
+ Môi trường nuôi cấy VSV đã khử trùng (Bài 3)
1.2 Chuẩn bị bình nước vô trùng làm dãy pha loãng:
Chuẩn bị 10 bình tam giác hoặc bình cầu có dung tích 100ml hoặc 250 ml. Cho vào mỗi bình 90 ml nước máy (thường cho 92 ml, vì khi khử trùng bốc hơi khoảng 2 ml). Đem bình các bình đã có nước tiệt trùng hơi ở 1 atm (1210C) qua 30 phút. Lấy ra để nguôi sẽ được dãy pha loãng, đánh số thứ tự từ 1 đến 10.
1.3 Xác định độẩm mẫu cần phân tích:
Cân 10 gam mẫu cơ chất tươi cho vào hộp nhôm, có thể cân cả trong lượng họpp nhôm khi chưa có mẫu phân tích, sau đó đem sấy ở tủ sấy nhiệt độ 105 0C qua 4 giờ, đem hộp nhôm đã sấy ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi nguội. Đem cân trọng lượng, sau đó sấy nhiều lần như vậy đến khi trọng lượng không thay đổi, thì tính độ ẩm của mẫu phân tích theo công thức sau:
A - B
Độ ẩm X% = --- x 100 B - C
X: Độ ẩm %
A: Khối lượng hộp + cơ chất còn ướt. B: Khối lượng hộp + cơ chất đã sấy khô.
Tính hệ số khô kiệt k:
1 k = ---
1 - x
1.4. Chuẩn bị dãy pha loãng
Muốn đếm được số lượng vi sinh vật dễ dàng, khi phân tích cần pha loãng cơ chất đến một độ nhất định. Cần lưu ý rằng làm dãn mật độ VSV phải pha loãng tỷ lệ luôn luôn = 1/10
- Cân 10g cơ chất cho vào bình thứ nhất đã có 90 ml nước vô trùng, lắc 15 - 20 phút, trên máy lắc 150 lần/ phút. Như vậy chúng ta đã có dung dịch pha loãng 10-1, nghĩa là tỷ lệ 1:10.
- Dùng pipet 10ml hút 10 ml dung dịch ở nồng độ 10-1 cho vào 90 ml nước ở ống bình thứ 2, lắc đều, chúng ta có nồng độ pha loãng 10-2 , tỷ lệ 1:100.
- Tiếp tục làm như vậy đối với các bình thứ 3, 4…đến khi chúng ta có được dãy pha loãng cần thiết, tỷ lệ 10-3 , 10-4 ,10 …
Chú ý: các pipet đều phải khử trùng, mối một nồng độ pha loãng phải dùng 1 pipet riêng.
Có thể chuẩn bị dãy pha loãng bằng ống nghiệm có chứa 9 ml nước, hoặc bình tam giác có chứa 45 ml nước vô trùng …. rồi đem khử trùng như làm với bình tam giác. Nếu làm bằng ống nghiệm, thì chỉ cân 1 gam cơ chất khô, hoặc 5 gam cơ chất khô. Nghĩa là ta vẫn tạo được dãy pha loãng tỷ lệ 1:10. Để phân tán đều dịch cơ chất trong ống nghiệm dùng pipet hút dịch đưa lên đưa xuống nhiều lần nhưng không thổi khí.
2. Nuôi cấy
Khi đã có dung dịch pha loãng rồi, dùng pipét 0,1 ml lấy từ bình pha loãng nào đó trong dãy pha loang cấy vào trong môi trường đã chuẩn bị sẵn cho từng nhóm hoặc từng giống VSV định phân tích. Mỗi nồng độ ít nhất phải cấy 3 - 5 lần nhắc lại (số lần nhắc lại càng nhiều, thì kết quả có độ tin cậy càng cao). Cần cấy ít nhất ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp. Cấy xong dung que gạt thủy tinh vô trùng dàn đều dịch cấy trên mặt môi trường (nếu môi trường rắn hoặc bán rắn trên đĩa môi trường thạch). Còn cấy vào trong môi trường dung dịch trong các ống nghiệm hoặc bình dung dịch dinh dưỡng chỉ cân lắc nhẹ là xong.
Chú ý tất cả các hộp lồng hoặc các bình môi trường thí nghiệm đều phải đánh số thứ tự theo nguyên tắc sau: số mẫu nghiên cứu nồng độ pha loãng - số lần nhắc lại.
Ví dụ: 5.4.3 - nghĩa là mẫu phân tích số 5; cấy ở nồng độ pha loãng thứ 4; cấy ở đĩa môi trường có số lần nhắc lại thứ 3.
Sau khi cấy xong cho đĩa, hoặc bình nuôi cấy vào trong tủ nuôi, nuôi ở nhiệt độ thích hợp cho từng chủng giống VSV khác nhau trong thời gian nhất định (có thể từ 48 - 72 giờ, có giống phải nuôi lâu hơn mới hình thành khuẩn lạc)
Cùng một dung dịch cơ chất pha loãng có thể phân tích nhiều mặt như nấm, xạ khuẩn và các loại vi khuẩn … bằng cách cấy vào môi trường thích hợp. Môi trường có thể là dịch thể, có thể là thạch bằng và từ những khuẩn lạc đã mọc trên môi trường thạch bằng và những đặc trưng của môi trường dịch thể, chúng ta có thể tính số lượng của vi sinh vật.