II. CHUẨN BỊ CÁC MÔI TRƯỜNG ĐỂ NUÔI CẤY VI SINH VẬT
5. Khử trùng môi trường dinh dưỡng
Khử trùng là một trong những biện pháp cần thiết và quan trọng nhất trong thực nghiệm vi sinh vật học. Thuật ngữ " khử trùng" bắt nguồn từ tiếng La tinh với nghĩa là sự " làm tuyệt dục". Trong vi sinh vật học, khử trùng được hiểu là làm chết tất cả mọi vi sinh vật. Tiến hành khử trùng môi trường, dụng cụ, thiết bị và các thứ khác để tránh sự phát triển lẫn lộn của các hệ vi sinh vật ngoại lai vào giống đang nghiên cứu. Việc khử trùng môi trường và dụng cụ là việc bắt buộc phải làm khi thực hiện tất cả các bài tập.
5.1. Phương pháp khử trùng môi trường dinh dưỡng
Môi trường dinh dưỡng được khử trùng chủ yếu bằng cách hấp trong nồi hấp áp lực. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc làm gia nhiệt các vật bằng hơi nước bão hoà dưới một áp suất lớn hơn áp suất của khí quyển. Khi áp suất hơi nước tăng lên thì nhiệt độ cũng tăng theo.
Tác dụng phối hợp giữa nhiệt độ cao và áp suất bảo đảm cho việc khử trùng thực hiện được tốt. Khi hấp áp lực sẽ làm tiêu diệt cả tế bào dinh dưỡng lẫn bào tử của vi sinh vật. Khi ghi chế độ khử trùng bằng các đơn vị áp suất 0,5 ; 1,0; 1,6; 2,0 atm có nghĩa là người ta muốn nói đến các áp suất bổ sung.Việc tăng áp suất hơi nước được tạo ra trong những thiết bị đậy kín thành dày, đóng kín các nồi hấp áp lực.
5.2. Chế độ khử trùng môi trường
Nhiệt độ và thời gian khử trùng bằng cách hấp áp lực trước hết được quyết định bởi thành phần của môi trường dinh dưỡng. Các cơ chất có chứa những chất không bền đối với nhiệt độ 1200C phải được khử trùng ở 0,5 atm. Sữa, dịch tự phân nấm men, nước nấm men và các môi trường chứa gelatin được khử trùng ở 0,5 atm trong 15 phút. Các môi trường có chứa đường, chẳng hạn như môi trường mạch nha, môi trường nước ép thực vật được khử ở 0,5 atm trong 20 -30 phút. Canh thịt - pepton và thạch - thịt - pepton được khử trùng ở 1 atm trong 20 -30 phút. Môi trường khoai tây nước chiết đất được khử trùng ở 1,5 atm trong 30 phút.
Để lựa chọn chế độ khử trùng phải tính đến pH của môi trường. Khi môi trường có phản ứng axit, các hợp chất cao phân tử trong đó có thể bị thuỷ phân khi hấp áp lực.
* Với các thành phần môi trường kém bền nhiệt có thể khử trùng theo các cách sau:
- Phương pháp Pasteur: đun nóng dung dịch ở 80oC/15 phút rồi làm nguội ngay.
- Phương pháp Tyndal: đun sôi cách thuỷ dung dịch trong 30 phút, lặp lại 3 lần mỗi lần cách nhau 24 giờ.
Hai phương pháp này chỉ có thể diệt các tế bào dinh dưỡng, không diệt được các bào tử kháng nhiệt.
- Sử dụng màng lọc vi khuẩn: thường dùng để khử trùng các thành phần như chất kháng sinh, vitamin….Kích thước của lỗ màng lọc vào khoảng 0,2 - 0,45àm. Lọc khuẩn không loại được virus.
5.3. Cách làm đĩa thạch vô trùng
Tiến hành đổ môi trường ra đĩa trong điều kiện vô trùng (sử dụng phòng vô trùng hoặc tủ cấy vô trùng đã được lau cồn và khử trùng bằng tia tử ngoại). Tay người làm cũng phải được khử trùng bằng cồn hoặc dung dịch sát khuẩn. Các đĩa petri phải được mới khử trùng trong vòng 24 giờ.
Bình môi trường mới được khử trùng, để nguội đến 50-60oC rồi mới đổ ra đĩa. Không đổ khi môi trường nóng >60oC để tránh hơi nước đọng trên nắp đĩa và mặt thạch sẽ dẫn đến dễ bị tạp nhiễm trong quá trình nuôi cấy. Trước khi đổ nên quay tròn bình để trộn đều môi trường, tránh lắc mạnh sinh bọt khí.
Sau khi đổ môi trường ra đĩa, nếu thấy các bọt khí phải dùng que cấy nung nóng đỏ châm vỡ bọt khí khi thạch còn nóng, chưa đông. Để yên cho thạch đông trong đĩa và nguội dần đến nhiệt độ phòng. Xếp các đĩa môi trường thành từng chồng, bao kín bằng giấy vô trùng.
Có thể làm khô mặt thạch và kiểm tra độ vô trùng bằng cách mở hé nắp
đĩa trong tủ cấy thổi khí vô trùng hoặc đặt các gói petri theo chiều ngược trong tủ ấm 2-3 ngày. Sau đó, chọn lựa các đĩa không nhiễm VSV để sử dụng.
5.4. Cách làm môi trường thạch nghiêng
Trước tiên cần lau sạch mặt bàn nơi sẽ đặt thạch nghiêng, đặt một thước (gỗ, nhựa) sạch cao khoảng 2-3 cm lên mặt bàn, khử trùng mặt bàn và thước bằng cồn. Trải một mảnh vải hoặc giấy vô trùng trùm lên mặt bàn và thước gỗ.
Sau khi khử trùng trong nồi hấp áp lực, cần làm nguội các ống môi trường ở nhiệt độ phòng hoặc dưới quạt mát một lúc đến khi chỉ còn khoảng 50-60oC để tránh hơi nước đọng lại nhiều trên bề mặt thạch.
Nhẹ nhàng đặt ống môi trường nằm trên lớp vải hoặc giấy vô trùng, đầu có nút kê trên thước, điều chỉnh sao cho mép thạch cách xa nút bông 3-4 cm. Đặt các ống thành hàng xít nhau, hết một hàng lại đặt tiếp hàng sau gối lên hàng trước. Đối
với ống thạch dùng để giữ giống VSV chỉ cần đặt nghiêng vát một chút để môi trường giữ được độ ẩm trong thời gian dài.
Nếu có đủ dụng cụ, có thể cho các ống môi trường có cùng kích cỡ vào giá đựng nhiều hàng, rồi đặt cả giá ống nghiệm nghiêng đều một góc trên thước. Do tính chất đồng đều của các ô trên giá sẽ giúp các ống môi trường được nghiêng đều như ý muốn. Cách này giúp thao tác đặt nghiêng được nhanh và bề mặt thạch nghiêng đều hơn, có thể dễ dàng thực hiện với một số lượng lớn môi trường.
Trong quá trình làm thạch đông, không được rung bàn hay rung ống
thạch. Sau khi thạch đông, ống nguội hẳn mới gói các ống thạch nghiêng bằng giấy vô trùng, đặt vào tủ ấm 30-37oC để kiểm tra độ vô trùng và làm khô mặt thạch. Sau vài ngày lấy ra quan sát kỹ bề mặt thạch phát hiện các khuẩn lạc
VSV. Soi ống nghiệm dưới ánh đèn để tìm các khuẩn lạc chìm trong thạch.
Những ống thạch nghiêng vô trùng (không chứa các khuẩn lạc VSV) được dùng để làm thí nghiệm và giữ giống VSV.
* Câu hỏi ôn tập: Bài số 3
1. Thế nào là môi trường chuyên tính?
2. Trình bày Sự sai khác cơ bản của môi trường lỏng, rắn, bán rắn? 3. Trình bày các bước cần thiết để tiến hành chế tạo môi trường? 4. Các dụng cụ, hóa chất cần thiết để chế tạo môi trường?
Bài số 4
NUÔI CẤY VI SINH VẬT Mục đích, yêu cầu: Mục đích, yêu cầu:
+ Hiểu rõ yêu cầu đối với nghiên cứu VSV là mọi dụng cụ và điều kiện làm việc phải tuyệt đối vô trùng.
+ Biết được các kỹ thuật nuôi cấy VSV thông dụng.
+Biết được mỗi loại vi sinh vật yêu cầu môi trường và điều kiện nuôi cấy khác nhau.
Nội dung:
+ Thực hành thao tác nuôi cấy vô trùng trên đĩa thạch và ống thạch ngiêng.
+ Phương pháp ria cấy phân lập VSV
+ Xác định môi trường chuyên tính thích hợp cho một số loại VSV.