4. Sản xuất DNA microarray
4.2. Contact-tip deposition printing
Hình 4.5 Sản xuất DNA microarray bằng phương pháp Contact-tip deposition printing
Kỹ thuật này có giá trị thương mại vào năm 1997 bởi công ty Synteni, được nhiều nhóm nghiên cứu sử dụng để chế tự tạo mảng DNA. Đầu tiên người ta hoà tan axit nucleic sau đó nhúng kim nhọn vào để lấy ra một lượng dung dịch xác định tại đầu của nó. Sau đó gắn dung dịch này lên bề mặt của cơ chất (Hình 4.5). Trong thực nghiệm, dùng nhiều đầu kim cùng lúc. Trong một vài trường hợp, mũi kim có
một khe mang như là một chỗ chứa dung dịch để gắn vào mảng như hình dạng của một cây viết bi (Hình 4.6, Schena et al, 1995).
Công ty Genetic Microsystem (Woburn, Massachusetts, USA; Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA, USA) giới thiệu một kỹ thuật khác được gọi là hệ thống “pin- and-ring array” vào năm 1998 (Rose, 1998). Một vòng nhỏ bán kính vài milimet được nhúng vào dung dịch nucleic acid. Một màng hay lamella được hình thành trong vòng bởi cường độ bề mặt như cái màng xà phòng của trò chơi con nít khi thổi bong bóng xà phòng (Hình 4.7)
Hình 4.6. Hình ảnh ví dụ của một mũi kim sử dụng cho phương pháp contact-tip deposition printing. A. Tip với kích thích 0,004 cm sử dụng cho việc tạo các phiến có các điểm có đường kính từ 50 đến 120 milimet. B. Tip kích thích 0,025 cm sử dụng cho việc tạo các phiến có các điểm có đường kính 100 milimet. C. Tip kích thích 0,025 cm sử dụng cho việc tạo các phiến có các điểm có đường kính khác nhau. D. Tip với 0,20 milimet cho việc chuẩn bị các điểm có chứa mẫu dò lớn với các đường kính khác nhau (Stanford University, California, USA).
Hình 4.7. Sản xuất microarray bằng kỹ thuật pin-and-ring array
Các nucleic acid gắn kết rất kém trên các phiến thủy tinh thô do đó phải tiến hành xử lý trước khi gắn DNA vào. Poly-L-Lysine mà gắn kết với các phân tử sinh học bởi các tương tác ion, thường được sử dụng cho mục đích này. Các microarray có thể được sử dụng một lần, tuy nhiên, do điều kiện về nồng độ của muối đòi hỏi phải loại bỏ các mẫu DNA-lai cũng được phân tách từ các mẫu dò cố định từ trên bề mặt của phiến array. Hơn nữa, các mẫu dò nucleic acid được phủ phiến như theo
phương pháp này sẽ làm giảm các lai kinetivà cs bởi sự cản trợ steric. Vấn đề này được tránh khỏi hay ít nhất cũng được làm giảm bởi việc sử dụng như là các linker của các phân tử như là việc thu nhận các oligoehtyleneglycol để phân tách ra các DNA bất động từ bề mặt array.
Bề mặt kính thường được xử lý bằng muối mà kết hợp tốt với các DNA bởi các tương tác theo quy luật Schiff-base, do đó, có thể ngăn cản việc loại bỏ các mẫu DNA trong suốt quá trình lai và bước tiến hành rửa mẫu và cho phép tái sử dụng các phiến array.
Phiến kính mà được sử dụng cho việc phát hiện các mẫu nucleic acid được đánh dấu bởi các chất phóng xạ có thể được phủ lên một màng nylon cho phép các mẫu dò DNA có thể gắn kết với sử hỗ trợ ánh sáng cực tím.
Do một lượng mẫu rất hạn chế nên đòi hỏi phương pháp contact-tip deposition printing được sử dụng phương pháp này để thiết kế các phiến array (phương pháp làm thông thường nhất). Các máy in mẫu dò thông dụng (‘spotters) được sử dụng một cách rộng rãi. Nhóm Pat Brown của trường Đại học Stanford, Califonia đã cung cấp giới thiệu công cụ trên (http://cmgm.stanford.edu/pbrown/mguide/index.html).
4.3.CP – Micro-contact printing
Phương phápCP – Micro-contact printing có nguyên lý tương tự phương pháp contact-tip deposition printing. rong đó, dùng “con dấu” polydimethysilane (PDMS) để chuyển axit nucleic lên bề mặt giá thể (Hình 4.8). Ưu điểm của vật liệu này là nó có thể sản xuất trên một cấu trúc rất nhỏ. Vào thời điểm viết sách này, các caon dấu đã được sản xuất với một kích thước có thể nhỏ hơn 50 nanomet. Theo lý thuyết, nó đã mở ra một thời kỳ sản xuất với một mức độ thu nhỏ sản xuất mới (Kumar và Whitesides, 1993). Tuy nhiên, các kết quả thực tế cho thấy rằng khi sử dụng phương pháp CP đã gây sự thất vọng trong quá trình thiết kế. Trong khi đó,
CP được sử dụng cho việc cố định các mẫu kháng thể trên bề mặt vàng (Morhard và cs, 1988), kỹ thuật này vẫn chưa được thành công trong việc sản xuất những mẫu dò với mật độ cao đòi hỏi trong việc sản xuất các DNA array.
Hình 4.8 Sản xuất DNA array bằng phương pháp sử dụng micro-contact printing.
4.4.FN-Micro-fluidivà cs net work (In vi kênh)
Kỹ thuật FN-Micro-fluidivà cs net work được cãi tiến từ CP. Trong kỹ thuật
FN, một con dấu PDSM có chứa đựng một kênh nhỏ được đặt trên một phiến kính bằng thủy tinh, vàng, polystyrene hay silicon/ silicone dioxide (Hình 4.8). Các kênh nhỏ này chứa dung dịch cơ bản sẽ được tiêm vào bề mặt bởi lực hút mao dẫn. Hệ
thống này được sử dụng cho việc cố định các mẫu kháng thể cho phép hoạt hóa các cơ chất bởi N-hydroxysuccinimidyl esters (Delamarche at el., 1997).
Tuy nhiên, tính khả thi của FN cho việc sản xuất các DNA array vẫn chưa được tập trung nghiên cứu đầy đủ. Vào thời điểm viết này, các con dấu PDMS có thể đo tới 3 milimet x 1 milimet đã được sử dụng cho việc thiết kế 100 mao mạch với độ sâu 1,5 milimet, chiều rộng 3 lilimet, và chiều dài 3 milimet trên các phiến cơ chất khác nhau (Ligher và cs, 1988).