III. Tài liệu tham khảo
2.Khái quát RNA
2.1. Cơ chế phân tử RNAi
Hình 1. Cơ chế của RNAi
(A) siRNA và shRNA tổng hợp được giả thuyết là một biện pháp hoàn hảo cho việc ức chế chuyên biệt các sản phẩm gene không mong muốn hoặc có thể gây bệnh. Các trình tự RNAi này có khả năng bám và sau đó phân hủy mRNA, ngăn không cho các mRNA này có thể khởi sự quá trình tạo protein độc hại và có nguy cơ gây bệnh, do đó có thể được điều khiển để khóa bất kì gene nào. Ngược lại, miRNA được mã hóa và tạo ra bởi các gene bên trong tế bào và điều khiển sự biểu hiện của nhiều gene liên quan đến các chu trình nội bào quan trọng.
(B) Con đường chuyển hóa RNAi liên quan đến việc trình diện dsRNA mạch dài với 2 nucleotide nhô ra tại đầu 3’ và sau đó được xử lí hiệu quả thành siRNA kích thước 21-25 bp bởi enzyme giống Rnase III có tên là Dicer. siRNA được tháo xoắn bởi helicase trước khi được đưa vào phức hợp nhiều tiểu phần RISC, mạch bổ sung với mRNA mục tiêu tương tác, gắn kết với RISC. Hoạt động endonuclease trong RISC có thể phân hủy hoặc ức chế sự dịch mã của mRNA chuyên biệt. Ngược lại, siRNA tổng hợp (21-25 bp) sẽ bỏ qua bước phân cắt bởi Dicer và được giải xoắn ngay bởi helicase, đi vào phức hợp RISCđể khóa chuyên biệt sự biểu hiện của mRNA.
Khám phá về RNAi trênC.elegans đã mở đầu cho một loạt những nghiên cứu thực nghiệm di truyền và sinh học với mục tiêu là xác định các phân tử liên quan
đến RNAi (theo Grishok, 2005). Cơ chế để đưa dsRNA mạch dài vào trong tế bào để thực hiện quá trình phân hủy mRNA mục tiêu được minh họa trên hình 1B. Việc nhận diện dsRNA được thực hiện bởi protein bám dsRNA có tên là RDE-4 (RNAi DEfective family member-4) (Grishok và cs, 2000; Tabara và cs, 2002; Tabara và Yasuda, 2003; Wang và Barr, 2005). Quá trình bám này tạo điều kiện cho sự phân cắt dsRNA thành các đoạn siRNA với kích thước từ 21-25 bp bởi enzyme Rnase III có tên là Dicer, tạo ra siRNA có 2 nucleotide nhô ra tại cả 2 đầu 3’ (Hammond và cs, 2000; Bernstein và cs, 2001a,b, 2003). Các đoạn siRNA này được tháo xoắn bởi enzyme helicase (hoạt động nhờ ATP) (Nykanen và cs, 2001). Đoạn siRNA mạch đơn sau đó đóng vai trò trợ giúp cho quá trình kết hợp của phức hợp protein để tác kích, phân cắt đúng vào sản phẩm phiên mã mục tiêu. Phức hợp RNA/protein này có tên gọi là phức hợp gây ức chế được cảm ứng bởi RNA (RNA-induced silencing complex hay RISC) (Hammond và cs, 2000). Tuy nhiên, các siRNA được tổng hợp (chiều dài từ 21-30 bp) sẽ bỏ qua bước được xúc tác bởi Dicer và chuyển thành dạng mạch đơn nhờ helicase, sau đó kết hợp với RISC để phân cắt chuyên biệt mRNA mục tiêu (Grishok và cs, 2001; Victor và cs, 2002; Timmons và cs, 2003; Hutvagner và cs, 2004).
2.2. Những ứng dụng của RNAi ở mứcin vivo
RNAi được sử dụng để tạo ra các hệ thống mô hình nhằm xác định các phân tử mục tiêu mới, hiểu biết chức năng của gene ở mức độ toàn bộ genome, tạo ra triển vọng mới cho các liệu pháp điều trị lâm sàng (PY Lu và cs, 2005, Xie và cs, 2006, Martin và Caplen, 2007). Gần đây, chúng tôi và các tác giả khác đã xem xét tổng quát triển vọng điều trị của siRNA tổng hợp trên nhiều bệnh và rối loạn khác nhau ở người (Pushparaj và Melendez, 2006). siRNA đã được kiểm nghiệm thành công trên nhiều mô hình bệnh khác nhau ở động vật, chúng tôi sẽ bàn luận về những nghiên cứu này trong phần sau của bài tổng kết.
2.2.1. RNAi (mứcin vivo) trong các bệnh về miệng2.2.1.1. Ung thư biểu mô vùng mũi-họng 2.2.1.1. Ung thư biểu mô vùng mũi-họng
Sự ức chế chuyên biệt sự biểu hiện gene của receptor của acid hyaluronic bằng RNAi trong dòng tế bào ung thư biểu mô vùng mũi – họng (CNE-2L2) đã dẫn đến hiện tượng giảm rõ rệt khả năng gây khối u của tế bào, bao gồm sự tăng trưởng, sự hình thành các colony trong điều kiệnin vitro, quá trình hình thành khối u, sự di căn khối u ở chuột nude (Jod và cs, 2007, Shi và cs, 2007a). Việc tiêm trực tiếp adenovirus có chứa siRNA với mục tiêu là CD44 vào khối u (được hình thành bởi việc tiêm dòng tế bào CNE-2L2 trước đó) ở chuột nude đã gây ra sự ức chế quá trình tăng trưởng khối u. Phân tích dữ liệu đã cho thấy có sự liên kết rõ ràng của sự biểu hiện của CD44 với hoạt động hình thành khối u của dòng tế bào CNE-2L2 và từ đó, các tác giả đề nghị một liệu pháp điều trị có hiệu quả khi đưa trực tiếp siRNA tác kích vào CD44 trên nhiều loại khối u trên người với sự biểu hiện mạnh gene mã hóa CD44.
2.2.1.2.Ung thư đầu và cổ
Để xác định các gene có khả năng mang vai trò là marker cho việc trị liệu ở mức phân tử của ung thư đầu và cổ ở người, Chen và cs (2007) sử dụng phương
hiện gene giữa mô ung thư đầu và cổ với biểu mô bình thường thu từ mô bệnh. Họ phát hiện ra desmoglein 3 biểu hiện khác nhau ở cả mức độ RNA và protein. Điều này cũng phù hợp với những phát hiện ở mức độ lâm sàng, việc ức chế desmoglein 3 bởi RNAi đã làm giảm rõ rệt sự tăng trưởng tế bào và sự hình thành colony từ 21- 57% ở 3 dòng tế bào ung thư đầu và cổ khác nhau. Thêm vào đó, những thí nghiệm dị ghép in vivo đã cho thấy việc đưa plasmid mang RNAi có mục tiêu tác động là desmoglein 3 có hiệu quả ức chế sự tăng trưởng khối u ở chuột nude BALB/C. Những khám phá về RNAi này đã cho thấy desmoglein 3 là một marker phân tử tiềm năng cho việc phát triển các liệu pháp dùng tá dược để chữa bệnh ung thư này.
2.2.1.3.Sự hình thành và phát triển của răng
siRNA cũng được dùng để khảo sát vai trò của các gene quan trọng liên quan đến sự hình thành và phát triển của răng. Bằng việc dùng RNAi chuyễn nhiễm bởi virus để knockdown các trình tự mRNA tương đồng (như msh-like 1) của vùng nội mô răng, các nhà khoa học có thể tái tạo răng với kiểu hình tương tự với mẫu
2.2.2. RNAi trong điều hòa những thay đổi của quá trình splicing
Hình 2 – Sự knockdown các đồng phân thông qua RNAi trong quá trình splicing. (A) siRNA chuyên biệt với Bcl-xL làm bất hoạt protein Bcl-xL và ức chế sự tăng sinh của tế bào kháng TRAIL và 5-fluorouracil. (B) RNAi ức chế hormone tăng trưởng ở người (hGH) có sự thay đổi trong quá trình splicing (không có exon 3).
Sự bất thường trong việc điều hòaquá trình splicing ở các gene có mức biểu hiện khác nhau đã được nhận biết là nguyên nhân của nhiều rối loạn di truyền trên người, trong đó có ung thư (hình 2A) (Faustino và Cooper, 2003; Garcia-Blanco và cs, 2004). Gene mã hóa cho hormone tăng trưởng ở người (hGH) bao gồm 5 exon và 4 intron. Nếu loại bỏ đi 4 intron thì sẽ tạo ra mRNA mã hóa cho toàn bộ protein hGH với trọng lượng phân tử 22 kDa. Nếu loại bỏ exon C, mRNA sẽ mã hóa cho protein có trọng lượng 17.5 kDa, protein này liên quan đến bệnh thiếu hụt hGH type
II (một dạng thiếu hụt hGH thường liên quan đến nhiễm sắc thể - GHD) (Lee và cs, 2000). Các liệu pháp điều trị với đích tác dụng chuyên biệt là dạng protein 17.5 kDa này có thể có hiệu quả trên các bệnh nhân bị IGHD type II (hình IIB) (Monson, 2003). Điều chắc chắn là RNAi có tiềm năng để trở thành một liệu pháp điều trị thay thế hiệu quả cho các liệu pháp hiện nay (vốn có nhiều tác dụng phụ như việc tăng nhẹ huyết áp ở não bộ và sự kháng insulin – Ryther và cs, 2004)
2.2.3. RNAi và các rối loạn thoái hóa thần kinh
Năm 2008, Wang và cs đã sử dụng siRNA để knockdown chuyên biệt gene SOD 1 bị đột biến để làm chậm quá trình xơ cứng và teo cơ vùng bên (ALS – amyotrophic lateral sclerosis). Có một nghiên cứu hiện nay được tiến hành bởi Công ty Alnylam Pharmaceuticals và các đồng sự từ Bệnh viện tổng hợp Massachusetts và Trường Y Massachusetts đã chứng minh được rằng các siRNA được tổng hợp hóa học để tác động lên các gene có liên quan đến bệnh Huntington đã cho thấy hiệu quả trong việc điều trị trên mô hình động vật. Nghiên cứu cận lâm sàng mới này cho thấy khi tiêm siRNA kết hợp với cholesterol để tác kích vào
huntingtin(một gene liên quan đến bệnh Huntington) đã cho kết quả là sự cải thiện tốt hơn tình trạng bệnh trên mô hình động vật: giảm các thương tổn của neuron và nâng cao khả năng vận động. Liệu pháp RNAi làm giảm sự biểu hiện của gene
huntingtinbị đột biến ở não và duy trì khả năng vận động của động vật thí nghiệm trong ít nhất một tuần.
2.2.4. Vai trò của RNAi trong viêm cấp tính và mạn tính
Sự nhiễm trùng và dị ứng là những bệnh thường gặp và có tác động quan trọng lên đời sống con người (Vlasenko và Melendez, 2005; Melendez và cs, 2007). Gần đây, chúng tôi đã công bố kết quả về việc ức chế chuyên biệt đồng phân của sphingosine kinase 1 ở mô hình chuột mang bệnh sẽ giúp cải thiện tình trạng bệnh viêm phúc mạc cấp tính được cảm ứng bởi C5a (Pushparaj và cs, 2008) và bệnh hen suyễn dị ứng (Lai và cs, 2008).