III. Tài liệu tham khảo
4. Thiết kế và tổng hợp siRNA có mục tiêu chuyên biệt
Việc lựa chọn phương pháp tạo siRNA là bước đầu tiên vô cùng quan trọng và có ảnh hưởng lớn đối với các quá trình xảy ra tiếp theo cũng như tính hiệu quả của RNAi đối với gene mục tiêu (Elbashir và cs, 2002). Nhiều thuật toán đã được công bố nhưng đến nay chúng vẫn chưa có hiệu quả rõ rệt, khó hiểu cũng như những hạn chế về tính khai thác thương mại. Holen (2006) đã công bố chương trình JAVA mã nguồn mở có khả năng dự đoán các siRNA hoạt độngvới hiệu quả gây nhiều bất ngờ (hệ số tương quan Pearson r = 0.52, n = 526 siRNA). Hiện nay, đã có nhiều cải tiến so với phiên bản 1.0 của chương trình mã nguồn mở này (http://sourceforge.net) (Holen, 2006).
4.1. Thiết kế siRNA theo cách truyền thống
Theo phương pháp thiết kế truyền thống, đầu tiên ta xác định và lựa chọn vùng trình tự mã hóa phù hợp của các protein điều hòa và dịch mã (ví dụ khoảng 115
base ở phía hạ nguồn so với codon khởi đầu). Trình tự motif được xác định bởi 2 nucleotide là AA (hoặc NA) nằm ở phía trước chuỗi trình tự khoảng 20 base với thành phần 35-75% G/C sẽ được lựa chọn. Hai nucleotide khởi đầu xác định thành phần trình tự của mạch 3’ đối mã và do đó, mạch đôi dài khoảng 20 bp với mục tiêu là AA (N20) sẽ mang đầu 3’ kết thúc là UU hay dTdT. Mạch đối mã này sẽ bắt cặp bổ sung hoàn toàn với trình tự mRNA mục tiêu. Tính trung bình, 65-75% siRNA mạch đôi được thiết kế theo phương pháp truyền thống sẽ có tác dụng làm bất hoạt gene từ 50-65%, tuy nhiên hiệu quả của sự knockdown gene khá biến động (Bernstein và cs, 2001a). Trong nhiều trường hợp, có ít hơn 70% gene bị knockdown không có chức năng sinh học cũng như ý nghĩa cho việc trị liệu. Điều này đòi hỏi cần có thêm các kĩ thuật mới nhằm lựa chọn có hiệu quả các siRNA có khả năng bất hoạt gene từ các siRNA được thiết kế theo cách truyền thống.
Thiết kế siRNA hiệu quả: Khi áp dụng phương pháp thiết kế siRNA truyền thống đối với 22 gene trong con đường truyền tín hiệu liên quan đến insulin, chỉ 25% trong tổng số 120 siRNA có tác dụng làm bất hoạt gene hơn 80%. Ngược lại, 48 trong tổng số 120 siRNA được thiết kế dựa trên các thông số chức năng của thuật toán đã cho thấy hiệu quả bất hoạt gene hơn 80% (Huang và cs, 2004). Tính trung bình, các siRNA được thiết kế theo cách này đã cho hiệu quả ngoài mong đợi, làm bất hoạt gene tốt hơn so với siRNA thiết kế theo cách truyền thống.
4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của siRNA
Các thí nghiệm chính xác đã chứng minh hiệu quả của siRNA phụ thuộc rất lớn vào nhiều yếu tố, ví dụ như độ ổn định nhiệt động học của mạch đôi tại đầu 5’ đối mã, khả năng hình thành cấu trúc kẹp tóc bên trong phức hợp RISC (điều này có thể làm giảm khả năng gây bất hoạt gene của siRNA), thành phần GC, base adenosine tại vị trí 19 và 20 của mạch mang mã (yêu cầu cho bước giải xoắn/kích hoạt trong RISC), ngoài ra còn có các yêu cầu khác như base uridine được chỉ định nằm ở vị trí thứ 10, adenosine ở vị trí thứ 3, guanosine không được phép xuất hiện ở vị trí 13. (Khvorova và cs, 2003). Đã có những nghiên cứu về cách thức kéo dài hoạt động của siRNA bằng nhiều biến đổi hóa học (ví dụ như 2’-O-methylation) với mục tiêu là làm gia tăng độ ổn định của phân tử và duy trì hiệu quả bất hoạt gene (Chiu và Rana, 2003).
4.3. Sự vận chuyển siRNA
Có 2 loại vector với chức năng vận chuyển siRNA đã được phát triển bao gồm các vector virus và vector không virus. Vector không virus mang các ưu điểm như độc tính thấp, dễ dàng tổng hợp và ít gây đáp ứng miễn dịch mạnh (Zhang và cs, 2007). Khác với các loại plasmid, vector virus có khả năng vận chuyển siRNA vào các loại tế bào không phân chia như tế bào thần kinh. Chúng được sử dụng rất phổ biến trong công nghệ chuyển gen nhờ đảm bảo hiệu quả cao trong việc vận chuyển in vitro. Một ưu điểm của các vector lentivirus, so với adenovirus, chính là khả năng đưa các đoạn RNA nhỏ vào máu và tế bào tủy xương (Hannon và Rossi, 2004). Mặc dù các vector biểu hiện được sử dụng rộng rãi với mục đích hạn chế dạng RNA kết hợp RNAi trong in vitrovà in vivo, người ta vẫn lo ngại về mức độ độc tính của các vector virus khi sử dụng trên người (Reid và cs, 2002; McCaffrey và cs, 2003). Tuy nhiên gần đây người ta đã chứng tỏ việc sử dụng lentivirus mang
RNAi có thể được sử dụng để nghiên cứu chức năng gene trong quá trình phát triển răng ở động vật có vú (Song và cs, 2006).
Đồng thời rất nhiều nghiên cứu gần đây tập trung vào việc cải thiện các vector biểu hiện, giảm tối đa các tác dụng phụ, và thúc đẩy việc vận chuyển siRNA vào loại mô đích cụ thể. Chiến lược cơ bản nhất là dựa vào “tet-operable polymerase III-promoted shRNAs” và sự đồng biểu hiện của protein điều hòa tetracycline, TetR. Việc xây dựng ngân hàng shRNA đã được bàn thảo cụ thể (Bernards và cs, 2006). Chang và cs (2006) đã xây dựng được ngân hàng shRNA thế hệ đầu tiên theo miRNA tiền thân và ngân hàng thế hệ thứ 2 được xây dựng theo miRNA sơ cấp (ngân hàng Hannon-Elledge). Những ngân hàng này được sắp xếp và kiểm tra trình tự, phần lớn đã được hiểu rõ, và các geneđược dự đoán trong bộ gene người và chuột. So sánh giữa ngân hàng thế hệ 1 và thế hệ 2 cho thấy rằng các yếu tố kích hoạt RNAikhi đi vào con đường RNAi theo cách tự nhiên hơn sẽ cho hiệu quả bất hoạt gene cao hơn.
Những khảo nghiệm ở cấp độ lớn này mang nhiều tính năng, được sử dụng trong các nghiên cứu ngắn và dài hạn, cũng như trong quá trình bất hoạt gene cơ bản hoặc được cảm ứng. Các cassette trong thư viện lưu trữ thông tinkhi đưa vào thực nghiệm cho thấy chúng có thể dễ dàng đi vào vector có chứa những promoter khác nhau và/hoặc cung cấp những dạng khác nhau của vector virus (Chang và cs, 2006). Gần đây, ngân hàng shRNA và miRNA toàn bộ genome phù hợp với RNA dạng kẹp tóc ngắn (gọi là shRNA mir) đã được phát triển kết hợp với những tiến bộ trong thiết kế shRNA và tính hiệu quả của quá trình bất hoạt gene. Một hệ thống truy dò kết hợp sẽ phát hiện sản phẩm siRNA từ dữ liệu nhập vào của 1 trình tự đích mRNA, từ đó việc tổng hợp hóa học ở “barcode” dễ dàng và mang lại cơ hội ứng dụng cho những gen phức tạp ở tất cả các loài động vật (Fewell và Schmitt, 2006). Những tác nhân trong quá trình vận chuyển siRNAin vivođược miêu tả hình 4.
Hệ thống vận chuyển không virus, như atelocollagen sử dụng cho siRNA, có tính hiệu quả trong việc tầm soát chức năng các gen trongin vitrocũng như in vivo, hứa hẹn trở thành nền tảng cho những bước phát triển về sau trong trị liệu bằng RNAi. Những mảnh polymer và liposome ion dương cũng phù hợp cho việc vận chuyển siRNA. Các liposome ion dương mang siRNA được tiêm vào tĩnh mạch chuột và sử dụng điện biến nạp chuyển siRNA và shRNA để nuôi cấy phôi thứ cấp và tạo võng mạc. Liposome 5 tích điện dương được lactosyl hóa mang các nhóm lactose giúp cho việc trình diện siRNA vào dòng tế bào gan người dễ dàng, ngăn chặn sự nhân lên của HCV. Ở chuột, phức hợp siRNA và liposome 5 mang lactose tích lũy ban đầu ở gan, được phân phát vào các tế bào nhu mô gan một cách đặc hiệu và không phụ thuộc liều lượng sẽ làm giảm sự biểu hiện HCV trong mô gan, mà không có sự đáp ứng của interferon. Tiềm năng của apolipoprotein A-I (apo A- I) trong vận chuyển các nucleic acid trong cơ thể đến gan đã được chứng minh bằng hình ảnhin vivo real-time (Kim và cs, 2007). Thí nghiệm chứng minh siRNA tổng hợp có khả năng chống lại HBV, trong đó siRNA được hình thành bởi apo A-I và 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP)/ cholesterol (DTC-Apo), và tiêm vào tĩnh mạnh chuột thí nghiệm đã bị xâm nhiễm HBV. Những phân tử có kích thước nano này làm ức chế mạnh mẽ sự biểu hiện protein virus nhờ quá trình thực bào receptor. Ưu điểm của apo A-I mang siRNA là sự đặc hiệu của nó và gan, hiệu
quả của phương pháp cao chỉ với liều lượng nhỏ (< hay = 2mg/kg) trong 1 điều trị duy nhất và tác động kháng virus liên tục trong 8 ngày. Protein biến đổi kị nước là cholesteryl oligo-d-arginine (Chol-R9), được ổn định và tăng cường khả năng ức chế khối u hiệu quả mang siRNA mục tiêu VEGF. Phức hợp không cộng hóa trị giữa siRNA tổng hợp với Chol-R9 vận chuyển một cách hiệu quả siRNA trong in vitro. Hơn nữa, áp dụng ở mô hình chuột có mang khối u dưới da, phức hợp siRNA mục tiêu VEGF, không có dạng siRNA trộn, có tác dụng ức chế khối u (Kim và cs, 2006). Việc vận chuyển siRNA trong điều trị các bệnh về phổi cũng được tiến hành thông qua nhiều con đường và sử dụng nhiều loại vector khác nhau ở mô hình động vật. Tuy nhiên, thành công ở mức độ lâm sàng của sự can thiệp sử dụng siRNA cho các bệnh/đột biến ở người phụ thuộc chặt chẽ vào sự an toàn và hiệu quả của phương pháp vận chuyển cũng như tác nhân vận chuyển.
Hình 4 – Biểu đồ minh họa cho quá trình vận chuyển siRNA in vivo không sử dụng virus mà thông qua các chất hóa học, dùng cho trị liệu và khảo sát chức năng của bộ gene
5. Kết luận
Trong bài tổng kết này, chúng tôi đã cung cấp các thông tin về ứng dụng của RNAi ở mức in vivovà tiềm năng to lớn trong việc điều trị nhiều căn bệnh. Những thuận lợi về khả năng knockdown có hiệu quả tác động và hiệu quả kinh tế mà RNAi mang lại cùng với một lượng dữ liệu khổng lồ mà RNAi cung cấp cho chúng ta đã cho thấy vẫn cần có sự lựa chọn kĩ thuật cho các nghiên cứu về chức năng bộ gene và phát triển thuốc. Những tiến bộ gần đây của kĩ thuật RNAi microarray hứa hẹn sẽ gia tăng hiệu quả, tính kinh tế, thuận lợi trong khảo sát RNAi ở cấp độ toàn bộ genome. Và những phương pháp mới này sẽ đóng góp quan trọng cho sự phát triển công nghệ RNAi trong liệu pháp điều trị. Việc vượt qua sự khó khăn trong việc vận chuyển RNAi vào hệ thống sinh học vẫn còn là một thách thức lớn cần được giải quyết để có thể đưa việc điều trị bằng RNAi trở nên phổ biến. Giải quyết được vấn đề này sẽ giúp khai thác hết tiềm năng của công nghệ đầy triển vọng này. Ngoài ra, cơ chế phân tử của RNAome, bao gồm RNAi/RNAa vẫn cần được làm sáng tỏ để giải thích cho câu hỏi tại sao với cùng một enzyme trong con đường chuyển hóa RNAi, đôi lúc “mở” gene và đôi lúc lại “đóng” gene. Hiểu biết về các cơ chế này là một yêu cầu cần thiết đặt ra trước khi có thể đưa RNAi vào ứng dụng rộng rãi.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. siRNA, miRNA, and shRNA:in vivo applications
2. P.N. Pushparaj, J.J. Aarthi, J. Manikandan and S.D. Kumar 3. J DENT RES 2008 87: 992, DOI: 10.1177/154405910808701109
Chương 10