III. Tài liệu tham khảo
2. Phương pháp chuyển gene adenoviral vào trong não động vật 1 Vi tiêm
2.1. Vi tiêm
Chúng ta thường chấp nhận rằng adenovirus có thể nhiễm vào nhiều loại tế bào và không có sự khác biệt giữa các tế bào đang phân chia và các tế bào không hoạt động. Trung tâm neurone của động vật trưởng thành dễ bị nhiễm adenovirus bằng phương pháp vi tiêm. Phương pháp vi tiêm đã được sử dụng rộng rãi để đưa thuốc vào trong cấu trúc não và được biết rằng ảnh hưởng của thuốc phụ thuộc vào nồng độ và lượng tiêm của nó. Thông thường, các giải pháp tương đối tập trung và khối lượng nhỏ đã sử dụng vi tiêm để thực hiện. Trong những thí nghiệm này 3 giả thuyết chính được thực hiện. (1) Các thuốc này sẽ nhanh chóng lây lan và đạt được một sự tập trung “sinh lý” trong môt số lượng mô nhất định. (2) Tất cả các tế bào này có thể bị ảnh hưởng bởi thuốc với điều kiện là chúng có những receptor thích hợp dòng trao đổi chất. (3) Các thuốc sẽ không hoạt động bên ngòai những tế bào này của não, trừ khi gián tiếp thông qua một tác động tại vị trí tiêm. Tuy nhiên, những giả định không nhất thiết áp dụng cho các thí nghiệm chuyển gene virus.
2.2. Sự lây lan do chuyển gene
Trong phòng thí nghiệm này, adenovirus được sử dụng để thay đổi biểu hiện gene trong NTS của chuột. NTS này mở rộng ra hơn 1000µm theo hướng đầu đuôi và được bao quanh bởi cột sống lưng và những nhân của dây thần kinh vận động lưng bụng (hình 1). Hình 1B minh họa 1 thí nghiệm với 100nl adenovirus (5 ×109pfu/ml) thể hiện sự tăng cường của protein huỳnh quang màu xanh lá cây (EGFP) dưới sự kiểm soát của các promoter cytomegalovirus (CMV) được vi tiêm vào các NTS.
Năm ngày sau lát cắt não sống đã được kiểm tra dưới kính hiển vi hùynh quang. Trong những thí nghiệm này, sự lan truyền của các gene chuyển – EGFP là không quá 200-250 µm, ở cả hai hướng lưng bụng và đầu-đuôi. Để so sánh, vi tiêm angiotensin II với một khối lượng tương tự vào cùng một khu vực với độ bao phủ
tương tự 450-750 µm là nơi có lượng virus ít nhất gấp đôi. Điều đó có thể lập luận rằng các tín hiệu huỳnh quang ít nhạy và kết quả là các tế bào với biểu hiện hàm lượng thấp đã không được phát hiện. Như vậy, sự lây lan có thể cao hơn nếu có 1 kháng thể kháng EGFP và phân tích hóa miễn dịch được thực hiện. Tuy nhiên, EGFP là một protein rất ổn định với 1 half life hơn 20 giờ và trong các thí nghiệm của chúng tôi nó đã có đủ thời gian để tích lũy trong neurone. Trong hệ thống của chúng tôi, giới hạn phát hiện EGFP trong neruron não là 50-100 nM.Vì vậy, các tế bào không phát huỳnh quang có thể chỉ biểu hiện ở mức cận biên của chuyển gen hoặc không có gì. Rõ ràng vi tiêm 1 số lượng lớn virus sẽ ảnh hưởng đến một khối lượng lớn của não, nhưng sự tăng lên mạnh mẽ này có thể làm tăng nguy cơ tổn thương bộ máy của mô. Trong đa số các nghiên cứu chính, các loại thuốc đã được vi tiêm trong vùng này, với khối lượng của não được sử dụng trong các thí nghiệm của chúng tôi là 25-100nl. Do đó, những thí nghiệm của chúng tôi với adenovirus, chúng tôi sử dụng nhiều vi tiêm, khối lượng 100-300 nl để thu được gene chuyển đủ để làm thay đổi chức năng hệ thống phản xạ. Nguy cơ của sự hư hại bộ máy có thể khác nhau trong cấu trúc não khác nhau. Harding và cs (1998) sử dụng 1µl adenovirus (có chứa tổng cộng 107 pfu) để đạt được một sự lây lan 500-1000 µM của sự biểu hiện gene chuyển trong nếp cuộn não động vật có răng như vùng hippocampus của con bọ. Kammesheidt và cs (1996) tiêm 3 µl hơn 6 phút của 3×107 cfu virus vào 3 điểm để đạt được phạm vi bao phủ rộng lớn trên vùng hippocampus. Tuy nhiên, các tác giả nhận thấy điều này dẫn tới sự tổn thương mô tại chỗ tiêm. Mặc dù truyền rất chậm có thể giúp giảm nguy cơ tổn thương bộ máy mô, nó rõ ràng lượng tiêm nhỏ hơn thì tiêm an tòan hơn.
Sử dụng adenovirus nồng độ cao để làm tăng kích thước của vùng chuyển gen có lẽ không phải là cách tiếp cận tốt. như thế này sẽ làm tăng cường độ tổn thương tế bào do sự quá biểu hiện của chuyển gen và khả năng đáp ứng miễn dịch tại trung tâm của vi tiêm. Hàm lượng virus tối ưu nên được điều chỉnh cho phù hợp và có thể phụ thuộc vào loại promoter và gen chuyển được biểu hiện. Nhiều tác giả, những người làm việc với cấu trúc CMV dùng hàm lượng khỏang (1,26- 1,6 ) ×107 cfu (BillangBleuel và cs, 1997; Nishimura và cs, 1998). Vasquez và cs (1998) báo cáo rằng nồng độ gần 3,2 ×107không gây tổn thương tế bào.
2.3. Tất cả các tế bào tại vị trí tiêm đều nhiễm virus?
Chuyển gen adenovirus trong não sống bằng vi tiêm hầu như là rất khác với việc chuyển gen từ nuôi cấy tế bào hoặc ngâm những lát cắt của não. Khi virus CMV- EGFP được vi tiêm vào trong vùng hippocampus, có vẻ như là có một sự phong phú của những neuron hùynh quang màu xanh lá cây xung quanh vị trí tiêm hình dung trong lát não sống chuẩn bị 6-7 ngày sau đó. Tuy nhiên, dấu vết này có thể gây hiểu nhầm. Hình 2 cho thấy một neurone huỳnh quang trong vùng chuyển gen kết hợp sự giao thoa tương phản thị giác (DIC)với biểu hiện những đường vòng quanh của những neurons bao quanh tế bào huỳnh quang. Sự cân đối của những tế
bào hùynh quan đã được tìm thấy một ít trong tổng số những neurone hiện diện tại vùng này (trong trường hợp này là hippocampus, nhưng thường quan sát trên các NTS và một số vùng khác). Hàm lượng của virus được dùng trong thí nghiệm này ước lượng tại vị trí tiêm là dưới 50 phần tử virus/ neurone. Trong cơ thể, sự khác biệt chính giữa chuyển gene adenoviral và vi tiêm thuốc đó chính là do số lượng. Liệu ảnh hưởng trên những tế bào có đủ dài và tập trung?
Adenoviral được đưa vào tế bào bằng 2 con đường.Một, protein sợi của virus tương tác với 1 loại receptor hiện diện trên màng, giống như phân tử MHC lớp I và receptor “coxsackievirus- adenovirus”. Con đường thứ 2 đòi hỏi sự tương tác với tòan bộ họ protein cho phép sự tiếp nhận của virus. Trong khi hầu hết đầy đủ những receptor của những tế bào để gắn với protein cấu trúc của adenovirus, sự tiếp nhận có sự lựa chọn hơn.Một câu hỏi đặt ra là : Các adenovirus xâm nhiễm tất cả các neurons với cùng một hiệu quả hay nó đặc biệt thích một số loại?
Abe và cs (1998) tìm ra rằng vi tiêm vào trong hippocampus, đa số những neurons chuyển gen biểu hiện Lac Z là những neurone nhỏ, hòa lẫn những neurons hình chóp, những neurons không được chuyển gen. Họ nhận thấy rằng có tế bào thành kinh đệm hình sao, nhưng không có tiểu thần kinh đệm, biểu hiện gene Lac Z. Trong lát cắt sâu hippocampus chuyển gen, Grisbeck và cs (1997)quan tâm tới cả neurons và thần kinh đệm được chuyển gene, nhưng không có triệu chứng biểu hiện của gene Lac Z được báo cáo. Nhân eurones mặt rất khó để chuyển với việc tiêm adenovirus 106 pfu, trong khi dùng với hàm lượng cao gây ra một đáp ứng miễn dịch mạnh và dẫn tới sự thải loại chuyển gen (Hermens và Verhaagen, 1997). Từ những kinh nghiệm của chúng tôi trong việc vi tiêm CMV-EGFP adenovirus (109 pfu/ ml) ảnh hưởng neurons chuyển gene trong giới hạn NTS, cấu trúc gần kề giống như dây thần kinh mê tẩu lưng và nhân của cơ vận động dưới lưỡi là loại neurons khác trong vỏ não mới. Tuy nhiên, chúng tôi lưu tâm rằng những tế bào giống như neuron trung gian nhỏ có thể rất dễ bị nhiễm chuyển gen, ngược lại những neurons lớn giống như những tế bào hình tháp trong cả vỏ não và hippocampus xuất hiện có sức chịu đựng hơn (S. Kasparov và J.F.R. Paton). Những vector khac1, virus adeno- phụ thường hướng tới sự khác biệt giữa những neurons phổ biến (Bartlett và cs, 1998; Peel và Klein, 2000).
2.4. Các adenovirus đã kết nối các điểm lại với nhau bằng cách chuyển ngược
Khả năng tồn tại vi tiêm của 1 adnovirus vào trong não có thể dẫn đến việc biểu hiện của chuyển gene trong những cấu trúc vào trong nhân được tiêm. Nói một cách khác, sự chuyển ngược của virus có thể dùng như 1 cách để chọn những neurons đích trong một số thí nghiệm. Có 1 số thí nghiệm đã được thực hiện: vi tiêm 100nl hỗn hợp CMV-EGFP adenovirus và dịch huyền phù Fluo-Ruby vào bên trái của hippocampus của bọ. Những hippocampus được chọn là những cấu trúc tiện lợi bởi vì một số lượng lớn những liên kết đã được mô tả.7 ngày sau khi reurone sống , những lát não cắt trong hippocampus và những vùng khác của nãođược hình
dung thông qua 1 kính hiển vi cùng tiêu điểm Leica SP. Nhiều tế bào đầy Fluo- Ruby đã được tìm thấy ở cả ipsi và 2 bên trong một số vùng não bao gồm những hippocampus 2 bên và những vùng vỏ. Ngược lại, không có sự biểu hiện của EGFP. Tất cả những tế bào hùynh quang ở những vùng xa (n>50) có chất lượng tương tự .Quan trọng hơn, một số những tế bào hùynh quang EGFP được tìm thấy tại điểm tiêm khác với 1 số neurone trung gian bao gồm cả Fluo-Ruby và EGFP.Trong một số động vật khác những thí nghiệm khác cho kết quả tương tự sau khi cùng tiêm Fluo-Ruby và CMV-EGFP virus vào trong neocortex.Trong nhiều trường hợp (> 50 động vật) khi adenovirus được vi tiêm vào trong NTS theo 2 hướng, không phát hiện sự chuyển ngược ở cuống phổi (S.Kasparov và J.F.R. Paton).
Trong những nghiên cứu gần đâu khi tiêm 5 µl dung dịch huyền phù adenovirus (1010 pfu/l) trong bơ phosphate saline kết quả là sự chuyển của những tế bào hippocampus hình tháp thấp, không có sự biểu hiện của chuyển gen ở những vùng xa (Nishimura và cs 1998). Tuy nhiên, khi virus lơ lửng trong 1 dung dịch ưu trương 1M mannitol, 1 lượng lớn sự chuyển ở cả trong lớp tế bào hình hạt và 1 số những tế vào ở vùng xa như vỏ entorinal xảy ra ở cùng 1 bên. Những đề nghị về sự chuyển ngược này là có thể khi sự đi vào của virus gây ra shock, tăng tính thẩm thấu.Tuy nhiiên, 1 trường hợp rõ ràng của sự chuyển ngược đã đạt được sau khi vi tiêm 1µl của 2×1010pfu/l adenovirus vào trong 9 điểm trong hạch đuôi (Bilang-Bleuel và cs 1997). Những tế bào chuyển được tìm thấy trên 2mm từ vị trí tiêm. Một số tác giả thì theo dõi nhiễu tế bào chuyển gen ngược trong chất xám đặc. Sự tăng khả năng của neurone dopaminergic có thể là do sự chuyển gene ngược dễ xảy ra.
Như vậy việc có thể thu được chuyển gene ngược với adenovirus vào hầu hết các vùng trong não là rất thấp. Biểu hiện của 1 gene chuyển có thể khoanh vùng trong vùng tiêm và trong so sánh mối liên quan giữa việc chuyển gene adenovirus với việc tiêm 1 loại thuốc. Những ảnh hưởng này với virus adeno-phụ tương tự như adenovirus (Chainberlin và cs., 1998) và tương phản với kết quả thu được đối với virus gây mụn dộp (Adersen và cs, 1993). Trong trường hợp cuối cùng, sau khi vi tiêm 1 virus gây mụn dộp vào trong những neurone vân biểu hiện Lac Z được tìm thấy ở cùng đằng trước vỏ, chất xám và thalamus.
2.5. Hạch cảm giác ngoại biên có thể được chuyển gen để nghiên cứu các quytrình trong đuôi hướng tâm sơ cấp? trình trong đuôi hướng tâm sơ cấp?
Sự di chuyển ra trước của chuyển gen bằng tiêm adenovirus của neurons cảm giác sơ cấp có thể phá vỡ một số khó khăn về công nghệ nghiên cứu cơ chế điều khiển tính hưng phấn tiền synap. Trong một số báo cáo gần đây, sự chuyển của những neurone hạch rễ lưng được thực hiện bằng cách tiêm trực tiếp adenovirus vào trong hạch rễ lưng đã thu được kết quả tốt (Glatzel và cs, 2000). Hơn nữa, sự chuyển gene adenovirus thành công trong những tế bào nút hạch bình thường (Meyrelles và cs, 1997).Sự quan tâm của chúng tôi hướng vào giao cảm nhằm vào trong NTS, chúng tôi tìm cách để kiểm tra chúng ta có thể chuyển những neurone
hạch u trong cơ thể. Những hạch u bên phải của bọ được tiêm với CMV-EGFP (gần 10 µl của 5×109 pfu/l) dùng 1 pipette thủy tinh tốt. Trong hình 4, nhiều bó neurone huỳnh quang có thể hình dung giới hạn hạch u 6 ngày sau khi tiêm. Những theo dõi này cho thấy tiềm năng về những phương pháp mới cho việc nghiên cứu các quá trình tự trị của hệ thống thần kinh, dùng chuyển gene adenovirus gián tiếp (và somato-sensory).
3. Sự sống sót của chuyển gene bằng những vector adenoviral
Trong một số trường hợp nó có thể quan trọng trong việc biểu hhiện lâu dài của chuyển gene từ những ảnh hưởng kinh niên.Sự tồn tại của những chuyển gene bằng những adenovirus có thể giới hạn bởi cả sự bài tiết tự phát của DNA virus và cơ chế đáp ứng miễn dịch đối với sản phẩm kháng nguyên là virus của những tế bào chuyển gene.Trong khi quá trình đáp ứng miễn dịch hạn chế những giá trị của adenovirus trong chuyển gene vào trong tế bào ngòai biên, những đáp ứng này kém mạnh ở trong não và có thể ngăn cản bởi loại thuốc ức chế miễn dịch (Geddes và cs, 1996). Geddes và cs(1996) đã chứng minh rằng gene Lac Z đưa vào dùng adenovirus vào trong nhân cận não thất của vùng dưới đối tiếp tục tồn tại ít nhất 2 tháng. Trong những con khỉ sự tồn tại của chuyển gene tốt hơn với 1 hàm lượng trung gian của virus (6×108 pfu) hơn là với 1 hàm lượng cao (2× 109 pfu; Bohn và cs 1999) điều này dẫn tới một sự đáp ứng miễn dịch mạnh. Trong tiểu não 1 khả năng chuyển neurone đặc biệt không có một cơ chế đáp ứng miễn dịch rõ ràng khi vi tiêm 108 adenovirus (Hashimoto và cs, 1996). Cả những nhân đơn dễ vị xâm nhập và những u thần kinh đệm bao quanh những vị trí tiêm của cột dây sống sau khi tiêm 1012pfu/ ml hàm lượng adenovirus biểu hiện LacZ dưới sự điều khiển của promoter virus sarcoma Rous (Boulis và cs, 1999…) .