III. Tài liệu tham khảo
2. Khả năng điều trị của RNA can thiệp
Tế bào ung thư phát sinh từ sự tích lũy và chọn lọc nhiều đột biến liên tiếp có lợi cho sự phân chia và tồn tại của chúng. Những biến đổi di truyền và đôi khi trên vật chất di truyền (epigenetic) giúp tế bào ung thư vượt qua được sự khống chế của các nguyên tắc điều hòa tế bào và cơ thể, như quá trình chết theo lập trình của tế bào (apoptosis) hoặc các tín hiệu kìm hãm phân chia (antiproliferative signals). Quá trình biến dạng từ một tế bào bình thường sang một trạng thái không tuân lệnh và thường là nguy hiểm cho sự ổn định của cơ thể chủ thoạt đầu được nghĩ là một điều kiện chọn lọc chỉ có lợi cho tế bào ung thư. Nhưng khi nhìn kỹ vào cách thức sinh tồn của tế bào ung thư người ta dần dần hiểu rằng sự tích lũy nhiều đột biến di truyền cũng làm cho tế bào ung thư dể dàng nhạy cảm với những thay đổi xung quanh. Thí dụ một dạng ung thư đã thành công trong việc tăng cường sản phẩm của gene A hoặc làm giảm hoạt động của gene B. Dạng ung thư này trở thành không thể thiếu với sự có mặt liên tục của sản phẩm gene A hoặc sự vắng mặt của gene B. Khi tế bào ung thư này đột ngột bị mất đi nguồn sinh tồn là sản phẩm gene A hoặc thình lình chạm trán với sản phẩm gene B, nó sẽ không còn trong lợi thế sinh tồn mãi mãi nữa và có thể bị diệt vong. Hiểu biết những điểm yếu này của tế bào ung thư sẽ giúp tìm ra được phương tiện tấn công và tiêu diệt tế bào ung thư một cách đặc hiệu.
Sự khám phá ra cơ chế can thiệp RNA không lâu được nhận thức rằng đây chính là công cụ cần thiết để dò tìm các cơ chế phân tử bị thay đổi trong tế bào ung thư. Do tính đặc hiệu của quá trình can thiệp RNA kết hợp với tính dễ dàng nhân rộng tiến trình thực nghiệm từ hàng ngàn gene lên tới toàn bộ genome trong một thí nghiệm, hệ thống các "điểm yếu" của nhiều dạng ung thư sẽ nhanh chóng được giải mã và hàng loạt thuốc đặc hiệu cho từng loại ung thư sẽ được điều chế dựa trên hệ thống điểm yếu này.
Các nhà nghiên cứu đã dùng nhiều phương pháp để đưa RNA can thiệp vào tế bào với mục đích khám phá các đường tín hiệu sinh tồn chỉ có ở tế bào ung thư. Nhiều phương pháp bắt đầu từ việc xây dựng một thư viện chứa các đoạn RNA can thiệp cho toàn bộ gene. RNA can thiệp có thể được tổng hợp từ hóa chất, từ sản phẩm PCR, từ DNA plasmids, hay từ retrovirus. Sau khi có được những thư viện này, người ta đưa chúng vào tế bào và bắt đầu sàng lọc để tìm ra đoạn RNA có độc tính đối với ung thư rồi từ đó giúp suy ra cơ chế phân chia không điều khiển của tế bào ung thư. Phương pháp thư viện RNA can thiệp cũng có thể được dùng để xây dựng một cây phân loại chức năng cho nhiều loại ung thư.
Những cây phân loại chức năng này sẽ giúp thúc đẩy quá trình điều chế thuốc đặc hiệu chống ung thư. Mặc dù cuộc chiến chống ung thư có thể còn kéo dài, hiểu biết về ung thư được nhanh chóng tăng lên do có nhiều tiến bộ về phương pháp cũng như công cụ nghiên cứu, mà quan trọng và gần đây nhất là can thiệp RNA. Kiến thức mới về cơ chế ung thư càng tăng dẫn đến nhiều hy vọng tìm ra thuốc trị có hiệu quả nhất. Khi những hiểu biết mới này kết hợp với các kiến thức tích lũy từ trước đến nay trong việc phòng và chống ung thư như được đề cập đến trong bản báo cáo về ung thư trên toàn cầu của tổ chức Y tế thế giới, chúng ta có quyền hy vọng rằng ung thư không còn là căn bệnh đáng sợ nữa ở thế kỷ 21. Quá trình can thiệp RNAi được thực hiện bởi 2 cơ chế: siRNA, miRNA
2.1.Con đường hình thành bộ máy can thiệp RNAi
2.1.1.Con đường hình thành siRNA
Quá trình hình thành siRNA diễn ra ở tế bào chất (cytoplasma ). Các đoạn dsRNA sợi kép được cắt bởi enzyme Dicer tạo ra những đoạn RNA ngắn (siRNA) Sau đó các siRNA được tháo xoắn dưới tác dụng của enzyme helicase và biến tính thành 2 mạch đơn khi gắng với phức hệ RISC.
- Trong 2 mạch đơn này, chỉ mạch nào có đầu 5’ có hoạt lực với Agronauttrong phức hệ RISC mới gắn được với phức hệ RISC => tạo phức hợp siRNA-RISC
- Mạch còn lại đầu 5’ không có hoạt lực với Agronaut => không liên kết với RISC. Sự xuất hiện của mạch đơn siRNA sẽ hoạt hoá RISC thành trạng thái hoạt động (RISC*)
2.1.2.Con đường hình thành miRNA
Quá trình hình thành miRNA diễn ra trong nhân (nuclear) và trong tế bào chất (cytoplasma).
*Trong nhân:
Các phân tử miRNA được tạo ra thông qua quá trình phiên mã từ các gen gọi là các phân tử miRNA nguyên thuỷ (pri- miRNA), các phân tử này có chúa các cấu trúc kẹp tóc (hairpin). Các phân tử pri- miRNA được cắt bởi enzyme Drosha để tạo thành những sợi Pre- miRNA (phân tử tiền microRNA ) => gọi là quá trình chế biến pri- miRNA. Các phân tử Pre- miRNA sẽ được di chuyển ra ngoài tế bào chất.
* Tại Tế bào chất:
Pre- miRNA sau khi được di chuyển ra ngoài tế bào chất => sẽ được enzyme Dicer cắt thành những đoạn RNA nhỏ (khoảng 19 – 21 nu). Các đoạn miRNA được tách đôi => tạo ra các sợi miRNA đơn. Trong đó sợi có đầu 5’ có hoạt lực vói Agronaut trong phức hợp RISC => sẽ kết hợp với phức hợp RISC tạo thành phức hệ miRNA-RISC.
2.2. Triển vọng của việc nghiên cứu ứng dụng RNAi
Việc nghiên cứu ứng dụng cơ chế can thiệp RNA có nhiều triển vọng to lớn mà con người có thể không ngờ tới được. Một số hướng nghiên cứu chính :
- Can thiệp RNA chống lại sự nhiễm virus
- Can thiệp RNA bảo đảm ổn định hệ gen bằng cách chống lại các yếu tố di truyền vận động (transposon):
- Can thiệp RNA như cơ chế kiềm chế tổng hợp protein và điều khiển sự phát triển có tổ chức
- Can thiệp RNA như cơ chế giữ gìn nhiễm sắc tử cô đặc và tăng cường phiên mã - Can thiệp RNA tạo một công cụ thí nghiệm mới để kiềm chế gene chuyên biệt. - Can thiệp RNA phải là một giải quyết hữu ích trong điều trị bệnh di truyền trong tương lai
Tóm lại: Dựa trên can thiệp RNA, ứng dụng điều trị cho bệnh nhân ung thư là một trong những tiến bộ nhanh nhất. Cụ thể hơn hiện nay các nhà khoa học đang tập trung cho đoạn shRNA với vật mang là virus. Về mặt lý thuyết, khi sử dụng một đoạn shRNA được thiết kế thích hợp, khả năng để RNAi được khai thác để làm im lặng là toàn bộ bộ gen. Thật vậy, việc siRNAi tổng hợp có thể knock down các gen đích ứng dụng vào các bệnh khác nhau trong cơ thể đã được báo cáo. Thử nghiệm thực tế, những gen đích là những gen có liên quan đến ung thư gọi là các gen sinh ung và thường các gen này có liên quan đến một loại ung thư nào đó, hoặc các gen gây apoptosis. Thêm vào đó, các gen đóng vai trò tương tác với khối u, chẳng hạn như các yếu tố liên quan đến sự hình thành mạch máu hoặc miễn dịch tự nhiên và những yếu tố này là những chất trung gian kháng với hóa trị hoặc xạ trị cũng là mục tiêu cho sự can thiệp. Ví dụ, bệnh ung thư như ung thư buồng trứng và ung thư xương đang được thử nghiệm điều trị với siRNAs và đang có những dấu hiệu thành công.
Một lĩnh vực điều trị thú vị hơn nữa là khu vực của miRNA gây ra khối u ác tính. Những ảnh hưởng trực tiếp của miRNA mà được tin rằng có khả năng điều hòa khoảng 1/3 mRNA trong quá trình phiên mã của tế bào cơ thể và có thể liên quan đến nhiều bệnh nhân. Sử dụng liệu pháp gen để thao tác miRNA các cấp độ đang là 1 cách tiếp cận hấp dẫn cho sự biểu hiện gen và xác định các liệu pháp đúng mục tiêu và hiệu quả. Nhiều báo cáo cho thấy có nhiều mối liên quan giữa miRNA và bệnh ung thư đang mở ra một tia hy vọng mới cho các bệnh nhân ung thư. Các kết quả gần đây chứng minh rằng biểu hiện của một 1 miRNA đơn độc có thể làm đảo lộn sự tiến triển của bệnh trong mô hình ung thư gan. Kết quả này mở ra một lĩnh vực điều trị mới thay thế liệu pháp sử dụng RNAi.
Những virus có khả năng lây bệnh cho người cũng là một đối tượng tuyệt vời cho sự can thiệp RNA. Bởi vì trong các sinh vật ngoại sinh chúng là sinh vật duy nhất có thể sống trong tế bào vật chủ mà không bị ảnh hưởng bởi các phương pháp điều trị. Ở đây, có một vấn đề mới đặt ra là làm sao hạn chế sự tăng sinh của virus. Tuy nhiên, người ta phải nhớ rằng một số loại virus đã thu được khả năng kháng virus chống can thiệp RNA. Ví dụ những cách tiếp cận thành công RNAi để chống lại virus gây bệnh cho con người bao gồm virus viêm gan B (HBV), Papilloma (HPV), virus SARS và virus nhiễm.
Các lĩnh vực trị liệu các bệnh có liên quan đến trao đổi chất, rối loạn cơ tim, thoái hóa thần kinh và bệnh di truyền. Một nghiên cứu gần đây cho thấy siRNA thành công trên PVÀ CSK9, một loại protein động vật có vú có chức năng phân giải protein và ảnh hưởng đến sự trưởng thành của các protein tiết và là dấu chỉ của cơ thể thừa cholesterol. Can thiệp siRNA vào protein PVÀ CSK9 mục đích làm giảm cholesterol huyết tương và tạo một liệu pháp trị hiệu quả để kiểm soát căn bệnh này. Thử nghiệm lâm sàng cho bệnh động mạch vành cũng được tiến hành, sử dụng một liệu pháp RNA hỗ trợ trong việc bất hoạt gen c-myc, đây là gen chịu trách nhiệm để tạo sự lưu thông máu sau khi đặt stent. Một nghiên cứu khác cho thấy xơ hóa gan hầu như được giải quyết hoàn toàn và kéo dài sự sống còn trong cơ thể chuột điều trị siRNA tổng hợp và sửa đổi. Hiệu quả đạt được đánh dấu một tiềm năng mới cho việc điều trị xơ gan của con người. Bảng dưới đây cung cấp một cái nhìn sơ bộ về thử ngiệm lâm sàng cho các trị liệu hiện tại bằng siRNA.
Các thử nghiệm lâm sàng đầu tiên được thực hiện bằng cách sử dụng siRNA để thoái hóa điểm vàng liên quan đến tuổi tác (AMD). Đầu năm 2004, công ty Sirna trình làng những dữ liệu đầu tiên cho một loại thuốc dựa trên sự can thiệp RNA. Một hợp chất AGN-745, trước đây là Sirna-027, chống lại AMD. Năm 2007, công ty OPOKO đã phát động giai đoạn III trong quá trình thử nghiệm lâm sàng bằng cách dùng Bevasiranib, một lớp đầu tiên trong hệ thống siRNA để làm tắt gen sản xuất nhân tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF), đây là nhân tố được cho là gây mất thị lực AMD. Thật không may, thử nghiệm này bị ngừng lại vào tháng 3 năm 2009 do một hội đồng độc lập cho rằng hiệu quả của thuốc này không như lý thuyết
dự đoán. Người ta phải ghi nhớ rằng các thử nghiệm lâm sàng được thực hiện với siRNA luôn cho kết quả khả quan nhưng vẫn chưa đủ cơ sở để kết luận về việc điều trị trên cơ thể người.
Thất bại của nghiên cứu lâm sàng trên thúc đẩy nghiên cứu tạo siRNA thế hệ thứ hai, ví dụ như shRNA-biểu hiện nhiều đoạn gen cũng như phương tiện chuyển giao hiệu quả cho các loại gen khác nhau.
Về nguyên tắc cơ bản,có nhiều cách khác nhau để kích hoạt RNA can thiệp. Hầu hết các ứng dụng lâm sàng của RNAi dựa trên cơ chế tổng hợp 21 nucletide với 2 mạch so le nhau 2 đến 3 nucleotide. Chế độ này tương đối qua nhanh, khi sự tập trung của siRNA được phân tán trong suốt giai đoạn phân chia tế bào. Hơn nữa, siRNA là những polymer tích điện âm do đó không dễ dàng xâm nhập màng phospholipid kép của tế bào. Ngoài ra, siRNA không được bảo vệ nên dễ dàng bị thoái hóa bởi Rnases huyết thanh.
Ngược lại, bên trong tế bào biểu hiện cấu trúc kẹp tóc RNAcó khả năng knock-down gen trong một khoảng thời gian dài. Điều trị các bệnh mãn tính, đòi hỏi quá trình này diễn ra trong một thời gian dài. Một phương tiện lý tưởng để mang shRNA phải thoát khỏi các tiêu thể trong tế bào và phải khả năng xâm nhập màng nhân. Virus và vector bắt nguồn từ khi chúng thực hiện chính xác công việc này và từ đó chúng trở thành một hệ thống phân phối lớn cho shRNA.
Can thiệp RNA trong tế bào có thể được gây ra từ các RNA nội bào biểu hiện một cấu trúc kẹp tóc shRNA hoặc miRNA tổng hợp. Đơn vị phiên mã cơ bản của shRNA là độ nhạy và các trình tự đối được liên kết bởi các cặp nucleotide không bắt cặp nằm trong loop. MiRNA gốc vòng thì biểu hiện như một phần của quá trình phiên mã sơ cấp. MiRNA nhân tạo giống với tự nhiên hơn RNA nội sinh và tương thích với enzym RNA polymerase II và tạo nhiều khả quan hơn trong điều trị. Nhưng cho đến nay, shRNA nhân tạo dựa trên miRNA đã được so sánh với những kết quả trái ngược nhau và có vẻ như sự lựa chọn luôn phụ thuộc vào chiến lược và kết quả mong muốn và đã được tìm ra bằng thực nghiệm.
Việc ngày càng phát hiện ra nhiều chức năng khác nhau của RNA là cơ sở cho quan điểm cho rằng RNA có thể là đại phân tử sinh học xuất hiện đầu tiên trong quá trình tiến hoá chứ Hơn nữa, sự khám phá ra can thiệp RNA không chỉ cung cấp cho chúng ta một công cụ thí nghiệm mạnh mẽ mới để nghiên cứu chức năng của các gene mà còn nuôi dưỡng những mong đợi của chúng ta về những ứng dụng tương lai của can thiệp RNA trong y học,nông nghiệp,...