- Nguyên tắc: Mẫu lấy dựa trên mục đích phân lập loại VSV nào, thì chọn cơ chất, số lượng mẫu cho phù hợp Không lấy ngẫu nhiên mấ t nhi ề u
2.2.2.3.Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân giải dầu
phân giải dầu
Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần MT đến khả năng phân giải dầu của các chủng tuyển chọn.[20]
- Nguyên tắc: Thành phần MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phân giải dầu của nấm sợi. Đánh giá sự ảnh hưởng này thông qua việc nuôi cấy ở MT giàu chất dinh dưỡng (MT phân lập) và nghèo chất dinh dưỡng (MT khoáng).
- Tiến hành: 2 ml bào tử nấm sợi (6,3.106 CFU/ml) + 47,5 ml môi trường Czapek- Dox hoặc MT muối khoáng và 2,5 ml dầu D.O trong bình tam giác dung tích 250ml.
- Yêu cầu: So sánh khả năng phân giải dầu của nấm sợi ở hai điều kiện trên trong cùng thời gian và nhiệt độ, để chọn môi trường phân giải dầu tốt nhất cho việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tiếp theo.
* Nghiên cứu khả năng phát triển của các chủng tuyển chọn trên môi trường tự nhiên.
Để xác định xem các chủng tuyển chọn trong môi trường tự nhiên có khả
năng phân giải dầu hay không? Chúng tôi dùng môi trường nước biển tự
nhiên không bổ sung thêm muối khoáng: Cấy 2ml bào tử nấm sợi (6,3.106CFU/ml) vào bình tam giác 250ml chứa 47,5ml nước biển và 2,5ml dầu DO và nuôi cấy tĩnh trong 15 ngày. Đánh giá bằng cách xác định lượng dầu bị phân giải.
Ảnh hưởng thời gian
- Nguyên tắc: Các chủng nấm sợi có tốc độ sinh trưởng khác nhau.
Để xác định ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng của nấm sợi RNM chủng tôi tiến hành thí nghiệm sau:
- Cách tiến hành: Sử dụng môi trường (MT2) cấy chấm điểm các chủng nấm sợi tuyển chọn. Để ở nhiệt độ phòng. Đo đường kính khuẩn lạc, mỗi lần cách nhau 24giờ nhằm xác định tốc độ sinh trưởng của nấm sợi.
Sử dụng môi trường (MT3) nuôi cấy và xác định lượng dầu phân giải bằng phương pháp 2.2.2.2 vào các ngày thứ 7,15, 23, 30.
- Yêu cầu: Đánh giá tốc độ sinh trưởng và khả năng phân giải dầu bằng cách so sánh đường kính khuẩn lạc và lượng dầu phân giải của các chủng nấm sợi trong cùng thời điểm.
Ảnh hưởng nguồn nitơ
- Nguyên tắc: Thành phần môi trường ảnh hưởng rất lớn đến khả
năng phân giải dầu của nấm sợi, trong đó có N. Để xác định được ảnh hưởng của nguồn N đến khả năng phân giải dầu của các chủng nấm sợi chúng tôi tiến hành thí nghiệm sau:
- Cách tiến hành: Chúng tôi dùng môi trường khoáng làm môi trường cơ sở, trong đó nguồn nitơ được lần lượt được thay thế bằng KNO3; NaNO3; (NH4)2NO3; (NH4)2C2O4; NH4Cl; (NH4)2SO4 ở các nồng độ khác nhau. Tính theo lượng nitơ của các chất lần lượt là 0,01%, 0,04%, 0,07%, 0,1% và 0,13%.
Hàm lượng nitơ bổ sung vào môi trường được tính theo công thức sau:
C1% = 14.n.m/m1.M
Trong đó: - n: Số nguyên tử nitơ có trong muối chứa nitơ.
- m: Khối lượng muối chứa nitơ trong 1lít môi trường. - m1: Khối lượng phân tử của muối chứa nitơ
- M: Khối lượng của dung dịch.
Ảnh hưởng của nguồn cacbon.
- Nguyên tắc: Các chủng nấm sợi có khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau để sinh trưởng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thí nghiệm sau,
để xác định ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của nấm sợi. - Cách tiến hành:Chúng tôi sử dụng môi trường nuôi cấy (MT4) trong nước biển, sacaroza lần lượt được thay bằng các nguồn cacbon sau: lactoza, galact-oza, CMC, maltoza. Trọng lượng các chất thay thế được lấy sao cho
hàm lượng cacbon trong các nguồn đó đúng bằng hàm lượng cacbon đó trong MT nuôi cấy. Cấy chấm điểm nấm sợi nghiên cứu trên bề mặt các MT tương
ứng. Sau đó đểở nhiệt độ phòng khoảng 3-4 ngày.
- Yêu cầu: Đánh giá khả năng sử dụng các nguồn cacbon bằng mức
độ phát triển của các khuẩn lạc qua độ lớn đường kính khuẩn lạc. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ảnh hưởng độ mặn
-Nguyên tắc: Áp suất thẩm thấu của môi trường có ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của VSV. Phần lớn VSV có khả năng tăng trưởng trong môi trường nhược trương. Khi thêm một chất tan như muối,đường vào dung dịch, chúng làm gia tăng áp suất thẩm thấu của dung dịch. Một số VSV có khả
năng chịu được nồng độ muối lên đến 10%, được gọi là ưa muối tuỳ ý, một số
khác cần nồng độ muối cao từ 15% đến 20% để tăng trưởng, được gọi là VSV
ưa muối cực đoan. Để thử khả năng chịu mặn ta tiến hành phương pháp sau: - Cách tiến hành:
+ Đo khả năng sinh trưởng:
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy thích hợp (môi trường MT2), có bổ sung các nồng độ muối NaCl nghiên cứu từ 0%; 3%; 5% và 10%.
Cấy chấm điểm các chủng nấm sợi nghiên cứu lên bề mặt các môi trường nghiên cứu, theo thứ tự nồng độ muối từ thấp đến cao.
Nuôi trong nhiệt độ phòng từ 4 ngày.
Dựa vào thời gian hình thành khuẩn lạc và đường kính khuẩn lạc của các chủng nấm sợi nghiên cứu để đánh giá khả năng chịu mặn của các chủng nấm sợi nghiên cứu. Mẫu đối chứng nuôi cấy trên môi trường không có muối.
Chuẩn bị bình tam giác 250ml chứa 47,5ml môi trường khoáng với nồng độ muối khác nhau từ 0%- 10% và 2,5ml dầu D.O nuôi cấy tĩnh ở
nhiệt độ phòng 15 ngày.
- Yêu cầu: Đánh giá mức độ phát triển và phân giải dầu của nấm sợi qua
đường kính khuẩn lạc và lượng dầu phân giải.
+ Nấm sợi phát triển mạnh ở nồng độ muối từ 0%- 3%: Ưa mặn tuỳ tiện. + Nấm sợi phát triển mạnh ở nồng độ muối từ 5%- 10%: Ưa mặn
Ảnh hưởng của pH.
- Nguyên tắc: Mỗi loài nấm sợi thích hợp với pH trong MT khác nhau. Vì vậy, khảo sát pH thích hợp cho sinh trưởng và phân giải dầu là rất cần thiết. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm sau:
- Cách tiến hành:
+ Đánh giá mức độ sinh trưởng của nấm sợi
Chúng tôi sử dụng môi trường nuôi cấy (MT2) nước biển. Sau khi thanh trùng MT, điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1M hoặc HCl 1M
để có giá trị pH khác nhau từ 4,0 đến 8,0 cách nhau mỗi khoảng là 0,5. Cấy chấm điểm các giống nấm sợi nghiên cứu. Sau đó, để ở nhiệt độ phòng trong 4 ngày.
+ Đo khả năng phân giải dầu:
Chuẩn bị bình tam giác 250ml chứa 47,5ml môi trường khoáng với độ pH khác nhau từ 4.0- 8.0 và 2,5ml dầu D.O nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ
phòng 15 ngày.
- Yêu cầu: Đánh giá mức độ sinh trưởng bằng cách đo đường kính khuẩn lạc, cân sinh khối nấm sợi và xác định lượng dầu phân giải.
Ảnh hưởng của nhiệt độ
- Nguyên tắc: Nhiệt độ là một trong những yếu tố MT ảnh hưởng trực tiếp đến mức độ sinh trưởng của nấm sợi. Để xác định biên độ nhiệt
- Cách tiến hành: Chúng tôi sử dụng môi trường nuôi cấy (MT2) nước biển. Thanh trùng MT, rồi cấy chấm điểm các chủng nấm tuyển chọn vào các lô thí nghiệm. Mỗi chủng nấm sợi của từng lô cấy vào 3 đĩa. Sau đó, để mỗi lô ở nhiệt độ khác nhau từ 20oC đến 40oC mỗi khoảng cách là 5oC trong 4 ngày.
- Yêu cầu:Đánh giá mức độ sinh trưởng của nấm sợi dựa vào độ lớn của khuẩn lạc ở mỗi lô và so sánh sinh trưởng các chủng nấm sợi khác nhau ở
cùng nhiệt độ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});