3) Đ ánh giá theo th a n g điểm . Kỹ th u ậ t nhuộm G ram - eosin.
STT Nội dung Có không
1 Chuẩn bị: Giá nhuộm Lam kính Que cấy Bình rửa
Dung dịch cô' định carnoy Thucíc nhuộm Gram eosin 2 Quy trình kỹ thuật:
2.1 Dàn tiêu bản 2.2 Làm khô tiêu bản
2 3 Cô định tiêu bản bằng dung dịch carnoy
2.4 Phủ dung dịch tím gentian trong 5 phút - rửa nước 2.5 Phủ dung dịch lugol kép trong 30 phút - rửa nước 2.6 Phủ dung dịch eosin 1% trong vài giây
2.7 Rửa nước, để khô
2.8 Soi kính hiển vi. Nhận định kết quả đúng
Các kỹ th u ậ t k h ác xây dựng C h eek iest và th a n g điểm tương tự.
KỸ THUẬT NUÔI CẤY NẤM
I. MỤC TIÊU HỌC TẬP
Sau k h i học xong b à i n ày, a n h (chị) có k h ả năng:
1) C h u ẩn bị đầy đủ phương tiệ n cầ n th iế t để nuôi cấy nấm . 2) T iến h à n h kỹ th u ậ t nuôi cấy n ấ m đúng quy trìn h .
3) Theo dõi và n h ậ n x é t được các k h u ẩ n lạc tro n g quá tr ìn h nuôi cấy.
II. NỘI DUNG
Nuôi cấy n ấ m là nhữ ng kỹ th u ậ t n h ằ m m ục đích p h â n lập và đ ịn h loại n ấm . T rong p h ầ n n à y chúng tô i chỉ giới th iệ u n h ữ n g kỹ th u ậ t đơn g iả n về nuôi cây n ấ m đê học viên có k h á i n iệm cơ b ản.
1. CHUẨN BỊ PHƯƠNG TIỆN1.1. D ụ n g c ụ : + Que cấy 1.1. D ụ n g c ụ : + Que cấy
+ Đ èn cồn. + Tủ ấm .
+ Tủ cấy vô khu ẩn : p h ầ n n à y h ế t sức quan trọ n g vì ngoài môi trư ờ n g có n h iề u nấm , nếu tủ cấy k h ô n g được vô k h u ẩ n dễ lẫ n n ấ m từ môi trư ờng vào.
1.2. M ô i t r ư ờ n g (Môi trư ờ n g p h â n lập cơ b ả n là môi trư ờng sabouraud).
1.2.1. M ôi trường sabouraud có glucose: + P epton lOg.
+ T h ạch sợi 20 g. + Glucose 40 g.
+ Nước thư ờng 1000 ml.
1.2.2. M ôi trường sabouraud có đường maltose:
+ P epton 10 g. + T h ạch sợi 20 g. + M altose 40 g.
+ Nước thư ờng 1000 ml.
1.2.3. M ôi trường sábouraud kliông có đường d ù n g đ ể bảo quản: + P epton 30 g.
+ T hạch sợi 20 g. + Nước thư ờng 100 ml.
C ách diều ch ế m ôi trư ờ ng sabouraud:
+ T rộn t ấ t cả các th à n h p h ầ n của môi trư ờ ng cho vào m ột b ìn h cầu đ áy dẹp. + H ấp từ từ tớ i k h i có n h iệ t dộ 120°c.
+ G iảm n h iệ t độ từ từ.
+ Lấy môi trư ờ ng ra, lọc ngay k h i m ôi trư ờ ng còn nó n g qua g iấy lọc hoặc bông.
+ P h â n phối ngay vào các ống n g h iệm , để n g h iên g . + T iệ t k h u ẩ n b ằ n g tia cực tím .
2. KỸ THUẬT NUÔI CẤY
Có n h iều kỹ th u ậ t nuôi cấy thư ờ ng dùng n h ấ t là m ôi trư ờ n g th ạ c h n g h iê n g .
2.1. N u ô i c ấ y n ấ m t r ê n m ô i tr ư ờ n g t h ạ c h n g h iê n g
2.1.4. Tay p h ả i mở ống chủng, hơ nóng m iện g ống tr ê n ngọn lửa đ èn cồn, đ ên khi nóng bỏng.
2.1.5. Ấn đầu que cấy còn nóng vào m ặ t th ạ c h cho nguội, lấy m ột í t b ệ n h phẩm .
2.1.6. Ria cây n h ẹ n h à n g tr ê n m ặ t th ạch . 2.1.7. Đ ốt que cây, đ ậy n ú t ông nghiệm . 2.1.8. Để ống ngh iệm vào tủ ấm 37°.
2.2. N u ô i c â y n ấ m t r ê n m ô i tr ư ờ n g lỏ n g
Các bước làm n h ư nuôi cấy n ấ m tr ê n môi trư ờ ng th ạ c h nghiêng.
2.3. N u ô i câ'y n ấ m t r ê n m ô i tr ư ờ n g t h ạ c h đ ĩa
Ưu điểm của kỹ th u ậ t n à y quan s á t được th u ậ n lợi cả ở p h ầ n rìa cũng n h ư p h ần đáy k h u ẩ n lạc.
2.3.1. Đ ốt que cấy.
2.3.2. Mở ống chủng, lấy m ột ít b ệ n h phẩm .
2.3.3. Tay tr á i cầm hộp th ạ c h , hé mở n ắ p hộp b ằ n g ngón cái và ngón trỏ . 2.3.4. Ria cấy n h ẹ n h à n g tr ê n m ặ t th ạ c h , đậy n ắ p hộp.
2.3.5. Đ ốt que cấy.
2.3.6. Để th ạ c h vào tủ ấm 37°
2.4. N u ô i c ấ y n ấ m t r ê n p h iế n k ín h
Kỹ th u ậ t n ày tố n ít m ôi trư ờng, giúp cho dễ theo dõi h ìn h th á i của n ấ m n h ấ t là đối với n ấ m m ả n h , dễ gẫy.
2.4.1. Nhỏ m ôi trư ờ n g lên lam kín h .
2.4.2. L ấy 1 ít b ệ n h p h ẩ m cấy lê n môi trường.
2.4.3. Đ ặ t k h u n g th u ỷ tin h để n g ă n cách m ôi trư ờ ng và k h u ẩ n lạc với lá k ín h . 2.4.4. Đ ậy lá kín h .
2.4.5. Để tủ ấm .
3. THEO DÕI NUÔI CẤY NẤM
Theo dõi, quan s á t quá tr ìn h p h á t tr iể n của k h u ẩ n lạc n ấm . Do n ấ m tro n g môi trư ờ n g để gây n h iễ m n ê n k h u ẩ n lạc n ấ m mọc dễ lẫ n vói các k h u ẩ n lạc cộng sinh. T rong quá tr ìn h theo dõi p h ả i th u ầ n k h iế t k h u ẩ n lạc n ấm , quan s á t dại th ể và quan s á t vi th ể.
3.1. T h u ầ n k h iế t k h u ẩ n lạ c n ấ m
3.1.1- Cho k h á n g sin h vào môi trư ờ ng d ể d iệ t vi k h u ẩ n . K h án g sin h thư ờ ng dùng là pen ix ilin , tetrax y clin .
3.1.2. T ách k h u ẩ n lạc riê n g rẽ cấy tiế p vào ống th ạ c h k h ác.
3.1.3. P h a loãng nấm : Đổ m ôi trư ờ ng có k h u ẩ n lạc đã mọc vào m ôi trư ờ n g th ạ c h đun nóng có n h iệ t độ 4 0 °c , sau đó đổ th ạ c h vào hộp lồng. K hi k h u â n lạc mọc lại, tá c h k h u ẩ n lạc cấy chuyển tiếp.
3.1.4. T h u ần k h iế t b ằ n g n h iệ t độ: cho các ống cấy vào tủ ấm có n h iệ t độ k h ác n hau (25°, 37°...). Mỗi ch ủ n g th íc h n g h i ở n h iệ t độ k h ác n h au th ờ i gian mọc k h ác nhau.
3.1.5. C ấy tru y ề n để th u ầ n k h iế t:
3.1.6. Chú ý th u ầ n k h iế t ngay từ k h i lấy b ệ n h p h ẩm
3.2. Q u a n s á t d ạ i t h ể n h ữ n g k h u ẩ n lạ c n ấ m
3.2.1. Q uan s á t tốc độ p h á t tr iể n của k h u ẩ n lạc:
- Có k h u ẩ n lạc mọc n h a n h , có k h u ẩ n lạc mọc chậm . - Có nhữ ng k h u ẩn lạc 3 th á n g sau k h i cấy mới mọc.
3.2.2. Q uan sá t h ìn h d ạ n g của k h u ẩ n lạc:
H ìn h d ạng của k h u ẩ n lạc r ấ t quan trọ n g tro n g đ ịn h loại nấm . - K huẩn lạc cơ th ể tr ò n hoặc d ạ n g chữ s...
- K huẩn lạc d ạn g tơ h ay lông, có k h i m ượt n h ư nhu n g , có k h i n h ẵ n .
3.2.3. Quan sá t bề m ặ t của k h u ẩ n lạc:
- Bề m ặ t của k h u ẩ n lac có th ể dều đ ặn , có th ể sùi. - Có th ể có nhữ n g v ế t n h ă n h ìn h cuộn não. - Có th ể có nhữ n g đường k h ía.
- Bề m ặ t d ạn g tia hoặc th à n h quầng.
3.2.4. Quan sá t rìa của kliu ẩ n lạc:
+ K huẩn lạc có th ể n h a m n h ỏ , d ầy hoặc m ỏng.
3.2.5. Quan sá t tâ m của k h u ẩ n lạc:
T âm k h u ẩ n lạc có th ể sùi hoặc lõm n h ư h ìn h phễu.
3.2.6. Quan sá t m à u sắc k h u ẩ n lạc:
+ M àu của k h u ẩ n lạc có th ể v àn g , đỏ đ en, tr ắ n g tuỳ th e o từ n g loại.
3.3. Q u a n s á t v i t h ể
D ùng ngòi b ú t chủng đậu n ạo k h u ẩ n lạc th à n h từ ng lá t m ỏng q uan s á t dưới k ín h lúp hoặc k ín h h iể n vi.
Quan s á t vi th ể giúp ta n h ậ n d ạng, n h ậ n đ ịn h về đặc đ iểm của các bộ p h ậ n din h dưỡng và sin h sả n của từ n g loại k h u ẩ n lạc.