C X chuẩn thêm vào
Kiểm nghiệm thuốc bằng ph−ơng pháp sinh học
4.3.2. Môi tr−ờng nuôi cấy vi sinh vật
Môi tr−ờng nuôi cấy là những chất dinh d−ỡng thích hợp nhằm đảm bảo cho vi sinh vật sinh tr−ởng và phát triển.
Môi tr−ờng cần có 3 điều kiện sau: Đầy đủ chất dinh d−ỡng theo yêu cầu thí nghiệm, có pH trong khoảng quy định và phải vô trùng.
Môi tr−ờng gồm 3 loại:
− Môi tr−ờng tự nhiên: nguyên liệu có nguồn gốc từ động vật hay thực vật (nh− cao thịt, cao men, pepton, tinh bột…). Thành phần có thể thay đổi tuỳ theo nguồn gốc nguyên liệu.
− Môi tr−ờng tổng hợp: bao gồm các hoá chất thuần khiết đã đ−ợc quy định và th−ờng hoà tan trong n−ớc.
− Môi tr−ờng bán tổng hợp: trong thành phần môi tr−ờng có cả các nguyên liệu tự nhiên và tổng hợp.
Pha chế môi tr−ờng là một khâu rất quan trọng trong các thí nghiệm vi sinh vật.
Độ chính xác của kết quả thí nghiệm phụ thuộc rất nhiều vào chất l−ợng môi tr−ờng.
4.3.2.1. Ph−ơng pháp pha chế môi tr−ờng
Khi pha chế môi tr−ờng cần tiến hành qua 6 b−ớc sau:
Chuẩn bị dụng cụ hoá chất:
Dụng cụ pha chế môi tr−ờng tốt nhất là bằng men hoặc thuỷ tinh. Các dụng cụ phải rửa sạch, hoặc tiệt trùng nóng tr−ớc khi sử dụng.
Nguyên liệu pha chế môi tr−ờng phải đảm bảo chất l−ợng, hoá chất phải tinh khiết. Nếu là các dạng bột hoặc tinh thể phải khô, không đổi màu, không chảy n−ớc. • • • • •
Cân đong nguyên liệu:
Các nguyên liệu phải đ−ợc cân đong chính xác, nhất là những hoá chất hoặc nguyên tố vi l−ợng có thể gây ức chế vi khuẩn (muối mật, sắt…) phải đ−ợc cân bằng cân phân tích.
Hoà tan nguyên liệu:
Th−ờng dùng n−ớc cất hoặc n−ớc khử khoáng để pha môi tr−ờng. Các hoá chất đ−ợc hoà tan nóng hoặc lạnh tuỳ theo tính chất của chúng. Môi tr−ờng không có thạch nên hoà tan lạnh hoặc nóng nhẹ. Môi tr−ờng có thạch cần đun cho thạch tan hoàn toàn sau đó mới cho các thành phần khác vào.
Điều chỉnh pH:
Khi điều chỉnh pH của môi tr−ờng nên thực hiện ở nhiệt độ 45 - 50oC để pH ít bị thay đổi sau khi tiệt trùng. Các dung dịch NaOH 1N và HCl 1N th−ờng đ−ợc sử dụng để điều chỉnh pH. Sau khi điều chỉnh pH, cần bổ sung n−ớc cho đủ thể tích quy định.
Làm trong môi tr−ờng
Các môi tr−ờng lỏng (bao gồm các chất hoà tan) phải trong để dễ quan sát sự phát triển của vi sinh vật. Sau khi hoà tan các chất, nếu môi tr−ờng đục cần phải lọc qua vải gạc hoặc giấy.
Đóng ống tiệt trùng:
Môi tr−ờng đ−ợc cho vào ống nghiệm bình nón hoặc bình cầu, tuỳ theo yêu cầu thí nghiệm. Khi đóng ống, không đ−ợc để môi tr−ờng dính vào miệng ống hoặc bình.
Môi tr−ờng cần phải đ−ợc tiệt trùng ngay sau khi đóng gói. Nếu để lâu, tạp khuẩn sẽ phát triển làm hỏng môi tr−ờng.
Các môi tr−ờng thông th−ờng đ−ợc tiệt trùng 110oC/30 phút hoặc 120oC/ 20 phút.
Môi tr−ờng có các chất dễ bị phá huỷ bởi nhiệt, cần tiệt trùng ở nhiệt độ thấp bằng ph−ơng pháp Tyndall, Pasteur, hoặc dùng lọc vi khuẩn. Môi tr−ờng đ−ợc lấy ra khỏi nồi hấp ngay sau khi tiệt trùng xong. Nếu để lâu trong nồi hấp môi tr−ờng bị chuyển màu và giảm chất l−ợng.
Pha chế môi tr−ờng từ hỗn hợp bột môi tr−ờng chế sẵn:
ở nhiều n−ớc trên thế giới có các loại môi tr−ờng d−ới dạng bột khô chứa đầy đủ các thành phần theo yêu cầu, các môi tr−ờng này đ−ợc làm từ nguyên liệu, hoá chất tinh khiết nên chất l−ợng môi tr−ờng đảm bảo và ổn định. Khi làm thí nghiệm môi tr−ờng đ−ợc pha với n−ớc theo tỷ lệ quy định, nh−ng phải
dùng n−ớc mới cất hoặc n−ớc khử khoáng, trung tính để pha chế. Nếu bột môi tr−ờng đã cũ cần phải kiểm tra lại pH sau khi làm môi tr−ờng.
4.3.2.2. Bảo quản môi tr−ờng
− Môi tr−ờng bột khô đ−ợc giữ ở 10 - 12oC trong điều kiện khô, tránh ánh sáng.
− Môi tr−ờng đã pha chế đ−ợc bảo quản ở 4 – 10oC trong 1 – 2 tháng tuỳ theo thành phần môi tr−ờng.
4.3.2.3. Các ph−ơng pháp tiệt trùng
Tiệt trùng là một quá trình làm cho một vật hoặc một sản phẩm không còn vi sinh vật sống đ−ợc. Tiệt trùng đ−ợc thực hiện bằng ph−ơng pháp vật lý, hoá học.
Chọn ph−ơng pháp tiệt trùng phụ thuộc vào tính chất lý hoá và độ bền vững của môi tr−ờng.
•
•
•
Tiệt trùng bằng nhiệt khô:
Ph−ơng pháp này dùng để tiệt trùng các dụng cụ thí nghiệm bền với nhiệt nh− bông, băng, vải, gạc, dụng cụ thuỷ tinh…
Điều kiện tiệt trùng là: 180oC/ 30 phút hoặc 170oC/ 1 giờ, hoặc 160oC/2 giờ. Các dụng cụ thuỷ tinh để đóng môi tr−ờng phải đ−ợc tiệt trùng khô tr−ớc khi dùng.
Tiệt trùng bằng hơi n−ớc:
Ph−ơng pháp dùng nhiệt −ớt th−ờng đ−ợc dùng để tiệt trùng môi tr−ờng nuôi cấy và các dụng cụ phẫu thuật.
− Môi tr−ờng th−ờng đ−ợc tiệt trùng bằng nồi hấp ở 121oC/ 15 phút.
Các môi tr−ờng dễ bị hỏng bởi nhiệt nh− môi tr−ờng có đ−ờng, sữa, bia, máu, albumin… cần tiệt trùng ở nhiệt độ thấp bằng các ph−ơng pháp sau: − Tiệt trùng gián đoạn (ph−ơng pháp Tyndall):
Môi tr−ờng đ−ợc hấp 3 - 4 lần ở nhiệt độ không quá 100oC trong 30 - 40 phút, cách nhau 24 giờ. Giữa hai lần hấp cho môi tr−ờng vào ủ ở 28 - 32oC/ 24 giờ cho bao tử nảy mầm. Các bào tử sống sót nảy mầm sẽ bị tiêu diệt ở lần hấp tiếp theo.
− Khử trùng nhiệt độ thấp (ph−ơng pháp Pasteur):
Đun cách thuỷ môi tr−ờng 60oC/ 30 phút, hoặc 73oC/ 15 phút sau đó làm lạnh đột ngột d−ới 10oC. Ph−ơng pháp này không diệt đ−ợc bào tử.
Ph−ơng pháp lọc:
Ph−ơng pháp lọc đ−ợc dùng để tiệt trùng các chất dễ bị phá huỷ bởi nhiệt. Cho chất lỏng chảy qua màng lọc có kích th−ớc lỗ lọc ≤ 0,22àm. Phần
chảy qua phễu đ−ợc đựng trong các dụng cụ vô trùng. Thiết bị lọc và màng lọc phải đ−ợc tiệt trùng tr−ớc khi dùng.
•
•
Ph−ơng pháp dùng tia bức xạ:
Tia tử ngoại (UV) đ−ợc dùng nhiều nhất để tiệt trùng các buồng pha chế, tủ cấy vi sinh vật.
Đèn tử ngoại phải đ−ợc chiếu trực tiếp, thẳng góc với nơi làm thí nghiệm và liều l−ợng chiếu phải đủ với diện tích buồng.
Tia UV ít có tác dụng diệt nấm, vì vậy khi khử trùng buồng pha chế cần phối hợp thêm ph−ơng pháp dùng hoá chất để khử nấm.