C X chuẩn thêm vào
Kiểm nghiệm thuốc bằng ph−ơng pháp sinh học
4.3.3.5. Kiểm tra tác dụng ức chế vi sinh vật của chế phẩm thử
Một số thuốc trong quá trình sản xuất đ−ợc thêm các chất bảo quản. Những chất này có thể ảnh h−ởng đến sự phát hiện vi sinh vật có trong chế phẩm.
Một chế phẩm ch−a biết có tác dụng ức chế hay không thì cần phải kiểm tra tác dụng ức chế đối với các vi sinh vật sau:
Lấy ít nhất 2 ống của mỗi loại môi tr−ờng phát hiện vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí, vi nấm, cấy vào một trong hai ống chế phẩm cần thử.
Cấy khoảng 100 tế bào (0,1 ml nhũ dịch vi sinh vật đ−ợc pha khoảng ở nồng độ thích hợp) Staphylococcus aureus (vi khuẩn hiếu khí), Clostridium sporogenes (vi khuẩn kỵ khí), Candida albicans (vi nấm) vào cả hai ống của các môi tr−ờng t−ơng ứng. Nuôi cấy 30 - 35oC/4 ngày đối với vi khuẩn và 25 - 28oC/7 ngày đối với vi nấm.
Trong thời gian nuôi cấy, nếu vi sinh vật phát triển giống nhau (mọc nhanh và phong phú) trong cái ống chứng và ống kiểm tra, chế phẩm thử đ−ợc coi là không có tác dụng ức chế.
Nếu các ống có chất thử, vi sinh vật phát triển yếu hoặc không phát triển so với ống không có chất thử, chế phẩm có chất ức chế.
Tác dụng ức chế của chất thử phải đ−ợc loại bỏ bằng cách pha loãng, trung hoà, hoặc dùng ph−ơng pháp màng lọc.
4.3.3.6. Ph−ơng pháp thử
Thử vô trùng có thể đ−ợc thực hiện theo hai ph−ơng pháp tuỳ theo tính chất của mẫu thử:
− Ph−ơng pháp lọc qua màng lọc vi khuẩn . − Ph−ơng pháp nuôi cấy trực tiếp.
•
•
•
Ph−ơng pháp dùng màng lọc:
Thiết bị lọc th−ờng bằng thuỷ tinh, thép không rỉ hoặc nhựa gồm hai bộ phận có thể tháo rời, ở giữa có l−ới đỡ màng lọc. Màng lọc có thành phần là nitrat celleulose th−ờng dùng lọc n−ớc, dầu, và dung dịch alcol yếu. Màng ecetat cellulose để lọc các dung dịch alcol mạnh. Lỗ màng lọc có nhiều kích th−ớc khác nhau, trong thử vô trùng th−ờng dùng màng có đ−ờng kính khoảng 50mm và đ−ờng kính lỗ màng lọc ≤ 0,45àm.
Thiết bị lọc và màng lọc phải đ−ợc tiệt trùng tr−ớc khi thí nghiệm .
− Dung dịch chất thử chảy qua màng lọc, các vi sinh vật đ−ợc giữ lại trên màng, cấy màng lọc vào các môi tr−ờng thích hợp để phát hiện vi khuẩn, vi nấm.
− Ph−ơng pháp màng lọc kiểm nghiệm đ−ợc các th−ốc có tác dụng ức chế vi sinh vật, đặc biệt là thuốc kháng sinh, nh−ng đòi hỏi thiết bị tốt và điều kiện vô trùng cao.
Ph−ơng pháp nuôi cấy trực tiếp:
Ph−ơng pháp nuôi cấy trực tiếp có kỹ thuật đơn giản, nh−ng khả năng phát hiện vi sinh vật giảm khi số l−ợng vi sinh vật có ít và phân phối trong một thể tích chất thử lớn. Ph−ơng pháp này không thực hiện đ−ợc với các chế phẩm có tác dụng ức chế và các chất kháng sinh, vì khi thí nghiệm chất thử đ−ợc cấy trực tiếp vào các môi tr−ờng nuôi cấy thích hợp cho các vi khuẩn, vi nấm.
L−ợng mẫu thử dùng trong thí nghiệm:
L−ợng mẫu thử cần cấy vào các môi tr−ờng tuỳ thuộc vào từng loại mẫu (bảng 4.1.).
− Chất lỏng là dầu hay dung dịch dầu phải thêm vào môi tr−ờng nuôi cấy 1% tween 80 hoặc các chất nhũ hoá khác với nồng độ thích hợp.
− Mẫu thử là dạng mỡ hay kem đ−ợc hoà loãng vào dung dịch pepton 0,1% vô trùng theo tỷ lệ 1/10 tr−ớc khi cấy vào môi tr−ờng, (dung dịch pepton, cần thêm tween 80 với tỷ lệ 1ml/ 1lít).
Kỹ thuật thử:
•
− Mẫu thử là d−ợc phẩm:
Dùng dụng cụ vô trùng cấy trực tiếp chế phẩm thử vào các môi tr−ờng phát hiện vi khuẩn, vi nấm theo số l−ợng quy định. Chất rắn là dạng bột có thể cho trực tiếp vào môi tr−ờng hoặc làm thành dung dịch hay nhũ dịch 1% sau đó cấy vào môi tr−ờng.
Bảng 4.1. L−ợng mẫu thử dùng cho thí nghiệm nuôi cấy trực tiếp
L−ợng chế phẩm trong một đơn vị đóng gói
L−ợng tối thiểu cho một môi tr−ờng nuôi cấy
Thể tích môi tr−ờng (ml) - Chất lỏng: Thể tích V < 1ml 1 ml ≤ V< 4 ml 4 ml ≤ V < 20ml 20ml ≤ V < 50ml 50ml ≤ V< 100ml V ≥ 100ml - Chất rắn: Khối l−ợng P< 50mg 50mg < P< 200mg P ≥ 200mg Toàn bộ một ống 1/2 ống 2ml 5ml 10ml Th−ờng 10%
Toàn bộ một đơn vị đóng gói 1/2 khối l−ợng của một đơn vị đóng gói 100mg 10 15 20 40 80 100 20 40 80
− Mẫu thử là băng gạc, chỉ khâu phẫu thuật nếu kích th−ớc và hình dạng cho phép, nhúng toàn bộ mẫu thử vào 100ml môi tr−ờng.
− Mẫu thử là dây truyền dịch: Cho dung dịch pepton 0,1% vô trùng chảy qua để thu đ−ợc ít nhất 15ml và cấy vào 100ml môi tr−ờng.
Môi tr−ờng phát hiện vi khuẩn đ−ợc nuôi cấy ở 30 - 35oC ít nhất trong 4 ngày, và ở 25 - 28oC ít nhất trong 7 ngày đối với vi nấm.
(Mỗi loại môi tr−ờng làm 2 - 3 ống thử song song).
• Nhận định kết quả:
Mẫu thử đ−ợc coi là vô trùng nếu sau thời gian nuôi cấy không có vi khuẩn, vi nấm phát triển.
Nếu có 1 hoặc nhiều ống có vi sinh vật mọc cần làm lại lần thứ hai (Tr−ớc khi làm lại thử nghiệm lần 2 cần phân lập xác định đặc tính hình thái của vi sinh vật ở các ống thử d−ơng tính):
− Nếu không có vi sinh vật → mẫu vô trùng.
− Nếu có vi sinh vật giống với lần một → mẫu thử không vô trùng.
− Nếu có vi sinh vật khác với lần một → thí nghiệm đ−ợc làm lại lần 3 với số l−ợng mẫu gấp đôi:
+ Không có vi sinh vật phát triển → mẫu vô trùng. + Có vi sinh vật mọc → mẫu không vô trùng.