1.3.1. Protein [12]
Protein (Protit hay đạm) là những đại phõn tử được cấu tạo theo nguyờn tắc đa phõn mà cỏc đơn phõn là axit amin. Chỳng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ cỏc liờn kết peptide (gọi là chuỗi polypeptide)
Axit amin được cấu tạo bởi ba thành phần: một là nhúm amine (-NH2), hai là nhúm cacboxyl (-COOH) và cuối cựng là nguyờn tử cacbon trung tõm đớnh với 1 nguyờn tử hydro và nhúm biến đổi R quyết định tớnh chất của axit amine. Người ta đó phỏt hiện ra được tất cả 20 axit amine trong thành phần của tất cả cỏc loại protein khỏc nhau trong cơ thể sống.
Protein là thành phần khụng thể thiếu của mọi cơ thể sống. Protein chiếm tới trờn 50% khối lượng khụ của tế bào. Chỳng đúng vai trũ cốt lừi của cấu trỳc nhõn, của mọi bào quan, đặc biệt là hệ màng sinh học cú tớnh chọn lọc cao.
Việc gắn kết với protein cú thể thực hiện theo cỏc kiểu: Liờn kết đồng húa trị giữa nhúm amine hoặc nhúm carboxyl của protein với cỏc phõn tử khỏc; liờn kết tĩnh điện; liờn kết kỵ nước; liờn kết hydro. Tựy thuộc vào cỏc cấu trỳc khụng gian của protein mà mỗi loại trong mỗi mụi trường sẽ cú khả năng liờn kết theo cỏc cỏch trờn.
1.3.2. Albumin - protein bovine serum albumin (BSA) [9]
Cỏc albumin là cỏc protein tan trong nước, tan ớt hơn trong nước cú muối. Đối với động vật cú vỳ, albumin là một protein huyết tương. Albumin khụng chỉ là protein chiếm phần lớn trong huyết tương mà cũn được phõn bố trong tất cả chất lỏng nội mụ của cơ thể. Trong cơ thể người, khoảng nồng độ bỡnh thường của albumin trong mỏu là từ 38 – 48 gam/lớt, nú thường chiếm khoảng 60% của protein huyết tương.
Vai trũ của albumin trong cơ thể sống: Ổn định ỏp suất thẩm thấu riờng; vận chuyển cỏc hormon tuyến giỏp; vận chuyển cỏc hormon khỏc đặc biệt cỏc hormon tan trong mỡ; vận chuyển cỏc acid bộo tự do, vận chuyển cỏc bilirubile khụng liờn
kết; vận chuyển phần lớn số thuốc; vận chuyển trytophane; liờn kết với cỏc ion calcium và cú vai trũ ổn định pH.
Albumin huyết thanh bũ – BSA (bovine serum albumin) cú đầy đủ cỏc tớnh chất như ở trờn. BSA cú phõn tử gam khoảng 69 kDa, kớch thước khoảng 4ì4ì14 nm3.
Thành phần axit amine trong BSA: protein BSA được hợp thành từ 607 axit amine gồm 35 nhúm cystiene, 99 nhúm carboxyl và 103 nhúm amine, 17 liờn kết disunfide (S-S). Sự cú mặt của cỏc liờn kết disunfide làm giảm cỏc tỏc động lờn BSA ở trong cỏc mụi trường pH 5 đến 7. Bởi vậy BSA được bảo vệ trong mụi trường pH trung tớnh.
1.3.3. Strepavidin (SA) [13]
SA là protein được tinh chế từ cỏc loại vi khuẩn Streptomyces avidinii. Liờn kết Biotin – SA là một trong những liờn kết khụng húa trị mạnh nhất được biết tới trong thiờn nhiờn. SA được sử dụng rộng rói trong sinh học phõn tử và cụng nghệ nano sinh học bởi phức hệ Biotin – SA bền trong cỏc dung mụi hữu cơ, cỏc tỏc nhõn sinh húa, nhiệt độ thay đổi và pH khỏc nhau.
Một trong những ứng dụng phổ biến nhất của SA là phỏt hiện cỏc phõn tử sinh học khỏc nhau. Liờn kết mạnh giữa SA với biotin cú thể được sử dụng để gắn kết cỏc phõn tử sinh học với nhau hoặc gắn phõn tử sinh học lờn một đế rắn.
1.3.4. Khỏng thể [3,8,14,15]
Khỏng thể (antibody) là cỏc phõn tử globulin miễn dịch (immunoglobulin) cú bản chất glycoprotein, do cỏc tế bào lympho B cũng như cỏc tương bào (biệt húa từ lympho B) tổng hợp và tiết ra giỳp hệ miễn dịch nhận biết và vụ hiệu húa cỏc tỏc nhõn lạ, chẳng hạn cỏc vi khuẩn hoặc virus (khỏng nguyờn).
Cỏc khỏng thể cú cấu trỳc hỡnh chữ Y, cú hai bộ “cành” gắn vào một “thõn” (Hỡnh 1.19). Phõn tử khỏng thể cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptide, gồm hai chuỗi nặng H (heavy) giống hệt nhau và hai chuỗi nhẹ L (light) cũng giống hệt nhau. Cú hai loại chuỗi nhẹ κ (kappa) và λ (lambda). Cỏc chuỗi của immunoglobulin liờn kết với nhau bởi cỏc cầu nối disulfide và cú độ đàn hồi nhất định (Hỡnh 1.21). Một phần cấu trỳc của cỏc chuỗi thỡ cố định nhưng phần đầu của hai "cỏnh tay" chữ Y thỡ rất biến thiờn giữa cỏc khỏng thể khỏc nhau, để tạo nờn cỏc vị trớ kết hợp cú khả năng phản ứng đặc hiệu với cỏc khỏng nguyờn tương ứng, điều này tương tự như một enzyme tiếp xỳc với cơ chất của nú. Cú thể tạm so sỏnh sự đặc hiệu của phản ứng khỏng thể-
khỏng nguyờn với ổ khúa và chỡa khúa. Khỏng thể chỉ kết hợp đặc hiệu duy nhất với loại khỏng nguyờn đó sinh ra chỳng.
1.3.5. Khỏng nguyờn [4,7,14,15]
Khỏng nguyờn (antigen) là tất cả cỏc chất, đụi khi kể cả thành phần cấu tạo của cơ thể (thụng thường là protein hay polysaccharide) khi xõm nhập vào cơ thể sinh vật sẽ gõy nờn một đỏp ứng miễn dịch dẫn đến sự tổng hợp những phõn tử đặc biệt gọi là khỏng thể dịch thể hay khỏng thể tế bào và chỳng cú đặc tớnh liờn kết đặc hiệu với khỏng nguyờn đú.
Tớnh đặc hiệu của một khỏng nguyờn là đặc tớnh mà khỏng nguyờn ấy chỉ cú khả năng kết hợp đặc hiệu với khỏng thể tương ứng (trong trường hợp đỏp ứng miễn dịch dịch thể) và cú khả năng kết hợp đặc hiệu với cỏc thụ thể bề mặt cỏc lympho (bạch cầu) T (trong trường hợp miễn dịch tế bào). Khỏng nguyờn nào thỡ khỏng thể đú, khỏng nguyờn gắn với khỏng thể như chỡa khúa gắn vào ổ khúa. Tớnh đặc hiệu của khỏng nguyờn - khỏng thể là do sự tương đồng về cấu trỳc húa học giữa một phõn tử khỏng thể với một nhúm quyết định khỏng nguyờn.
Thụ thể HER-2/neu [11]: HER-2/neu là thụ thể trờn màng tế bào thuộc nhúm
thụ thể của yếu tố tăng trưởng thượng bỡ. Hiện nay thụ thể này được quan tõm nhiều trong bệnh ung thư vỳ vỡ nhiều nghiờn cứu cho thấy thụ thể này liờn quan đến sinh bệnh học, cũng như diễn tiến, tiờn lượng và đỏp ứng điều trị của bệnh ung thư vỳ.
HER-2/neu được xem là một trong cỏc khỏng nguyờn đặc hiệu ung thư cỏc tế bào biểu mụ, đặc biệt là ung thư vỳ vỡ nú biểu hiện yếu ở cỏc tế bào biểu mụ bỡnh thường, nhưng lại biểu hiện quỏ mức ở cỏc tế bào biểu mụ ung thư vỳ, ung thư buồng trứng, ung thư tử cung, ung thư phổi và ung thư đường ruột. Sự biểu hiện quỏ mức HER-2/neu thường cú tiờn lượng xấu, và là dạng ung thư "cú tớnh hung hón" hơn cỏc dạng ung thư khỏc, cú tỉ lệ tỏi phỏt cao sau khi điều trị. Vỡ vậy, HER-2/neu được xem là một đớch lý tưởng cho liệu phỏp điều trị miễn dịch.
Hỡnh 1.19. Cấu trỳc của một
1.3.6. Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) [167]
Vi khuẩn là một nhúm sinh vật đơn bào, cú kớch thước nhỏ (kớch thước hiển vi) và thường cú cấu trỳc tế bào đơn giản, khụng cú nhõn, bộ khung tế bào (cytoskeleton) và cỏc bào quan như ty thể và lục lạp. Hầu hết vi khuẩn cú kớch thước nhỏ, thường chỉ khoảng 0,5 – 5,0 μm, nhưng cú loài cú đường kớnh đến 0,3 mm. Chỳng thường cú vỏch tế bào, như ở tế bào thực vật và nấm, nhưng với thành phần cấu tạo rất khỏc biệt (peptidoglycan). Nhiều vi khuẩn di chuyển bằng tiờm mao (flagellum) cú cấu trỳc khỏc với tiờm mao của cỏc nhúm khỏc.
Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) là một nhúm vi khuẩn thuộc nhúm vi trựng đường ruột Enterobacteriaceae, cú nhiều trong tự nhiờn, trong đường ruột của người và gia sỳc. Cú hàng trăm chủng E. coli thuộc hệ vi sinh đường tiờu húa của người và cỏc loài động vật. Chỳng sống hài hũa một cỏch tự nhiờn trong ruột. Đụi khi chỳng cũng cú ớch cho sức khỏe của chỳng ta, như giỳp vào việc tổng hợp vitamin K, và vitamin B... Bờn cạnh cỏc chủng hiền thỡ cũng cú một số ớt chủng dữ cú khả năng gõy bệnh rất mạnh mà tiờu biểu nhất là E. coli O157:H7. Vi khuẩn E. coli O157:H7 tạo ra độc tố mạnh làm gõy bệnh tiờu chảy cú mỏu, gõy tổn thương thận ở con người. Chủng này đó gõy ra những vụ ngộ độc lớn trờn thế giới trong những năm gần đõy. Đặc biệt, liều lõy nhiễm bệnh do vi khuẩn E. coli gõy ra là rất thấp, sự cú mặt thậm chớ của một đơn vi khuẩn trong thức ăn cũng cú thể tạo ra một nguy cơ gõy bệnh. Bởi vậy sự dũ tỡm một cỏch đơn giản, nhanh và nhạy số lượng vi khuẩn để chống lại hoặc cực tiểu húa hay khử bỏ những truyền nhiễm tiềm tàng là rất quan trọng.
Về mặt sinh học, vi khuẩn E. coli là loại trực khuẩn gram õm, di động bằng tiờm mao quanh tế bào. Kớch thước trung bỡnh (0,5àm x 1-3àm) hai đầu trũn. Một số dũng cú lụng bỏm – khuẩn mao.
1.3.7. Phản ứng miễn dịch (phản ứng đặc hiệu khỏng nguyờn-khỏng thể) [4,14,126] [4,14,126]
1.3.7.1. Khỏi niệm
Là phản ứng xảy ra giữa khỏng thể đặc hiệu và khỏng nguyờn đó kớch thớch sinh ra chỳng. Phản ứng kết hợp này cú thể xảy ra in vivohoặc in vitro.
1.3.7.2. Cơ chế kết hợp khỏng nguyờn và khỏng thể
Sự gắn kết của khỏng thể với khỏng nguyờn được thực hiện trờn nguyờn tắc phự hợp cấu hỡnh khụng gian theo kiểu ổ khoỏ - chỡa khoỏ, trong đú ỏi lực liờn kết là một trong những đặc tớnh quan trọng.
Ái lực của khỏng thể đối với khỏng nguyờn là hợp lực của cỏc lực húa lý thụng thường vẫn gặp trong liờn kết enzyme với cơ chất, hormon với chất mang; hormon với tế bào đớch; phõn tử cú hoạt tớnh với thụ thể tế bào,... gồm cú: Lực hỳt tĩnh điện giữa cỏc nhúm chức với nhau (Vớ dụ giữa -COO- và -NH3+); lực liờn kết giữa cỏc cầu nối hydro với nhau; lực liờn kết giữa cỏc phõn tử với nhau hay cũn gọi là lực liờn kết Van der Walls; lực liờn kết kỵ nước: Một khi hai nhúm kỵ nước nằm đủ gần, thỡ chỳng sẽ liờn kết nhau sau khi loại trừ cỏc phõn tử nước ở giữa chỳng. Lực này chi phối 50% lực liờn kết khỏng nguyờn - khỏng thể núi chung.
Như vậy, một khỏng nguyờn cú thể được nhận diện bởi nhiều khỏng thể với độ đặc hiệu khỏc nhau, dũng khỏng thể nào phự hợp nhất về cấu trỳc 3 chiều với epitope sẽ được khuếch trương mạnh nhất.
1.4. Kết luận chương 1
Chương 1 đó trỡnh bày tổng quan về chất màu hữu cơ, cỏc hạt nano silica chứa chất màu hữu cơ và cỏc đối tượng sinh học liờn quan.
1. Đó trỡnh bày cỏc đặc trưng cơ bản của phõn tử màu hữu cơ như: cấu trỳc húa học, cấu trỳc mức năng lượng, cỏc dịch chuyển quang học. Tớnh chất quang và cỏc đặc trưng cơ bản của huỳnh quang của chất màu hữu cơ và cỏc yếu tố ảnh hưởng cũng được trỡnh bày chi tiết trong phần này.
2. Cỏc hạt nano silica chứa tõm màu hữu cơ được trỡnh bày và nờu bật được những ưu điểm của cỏc hạt nano chứa tõm màu so với cỏc phõn tử màu đơn lẻ.
- Cỏc phương phỏp chế tạo hạt nano silica chứa tõm màu bao gồm: phương phỏp Stober, cỏc phương phỏp micelle (micelle thuận và micelle đảo). Mỗi phương phỏp cú ưu, nhược điểm riờng và phự hợp với từng loại tõm màu.
- Cỏc đặc điểm nổi trội của hạt nano silica chứa phõn tử màu là độ chúi cao, độ bền quang cao, bền trong mụi trường sinh học, dễ dàng thay đổi kớch thước và nhúm chức năng trờn bề mặt hạt, thuận lợi cho việc ứng dụng trong cỏc phõn tớch sinh học.
- Cỏc ứng dụng của hạt nano silica chứa tõm màu trong sinh học với vai trũ là chất đỏnh dấu: hiện ảnh tế bào, phỏt hiện DNA siờu nhạy, đầu dũ đa chức năng, ứng dụng trong mỏy đếm dũng tế bào… và vận chuyển thuốc.
3. Cỏc khỏi niệm cơ bản của cỏc đối tượng sinh học liờn quan sử dụng trong cỏc ứng dụng sinh học như: protein, khỏng nguyờn, khỏng thể, vi khuẩn E. coli
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Cỏc thớ nghiệm chế tạo
2.1.1. Chế tạo cỏc hạt nano silica/ormosil (silica) chứa tõm màu RB bằng phương phỏp micelle thuận phương phỏp micelle thuận
2.1.1.1. Chế tạo và chức năng húa hạt nano silica chứa tõm màu RB
Với mục đớch tạo ra hạt nano silica dạng cầu, phõn tỏn trong nước, kớch thước vài chục nano một, cú cỏc nhúm chức năng như -NH2, -COOH, -SH, -OH trờn bề mặt. Phương phỏp micelle thuận đó được lựa chọn vỡ phương phỏp này cho hạt nano silica phõn tỏn trong nước, sử dụng dung mụi khụng độc (nước), kớch thước hạt cú thể thay đổi theo ý muốn. Cỏc nhúm chức năng được chế tạo theo hai cỏch:
1) Sử dụng precursor cú nhúm chức mong muốn để tạo phản ứng đồng trựng hợp với precursor gốc MTEOS. Nhúm chức này liờn kết trực tiếp với nguyờn tử Si, khụng tham gia vào cỏc quỏ trỡnh thủy phõn và ngưng tụ. Do đú hạt nhận được sẽ gồm một mạng nền silica cú cỏc lỗ xốp với cỏc nhúm chức khỏc nhau trờn bề mặt lỗ xốp và trờn bề mặt hạt. Cỏc phõn tử màu được phõn tỏn trong cỏc lỗ xốp.
2) Chế tạo cỏc hạt nano khụng cú cỏc nhúm chức năng trước, sau đú bọc bằng polyethylene glycol (PEG) với nhúm chức mong muốn. Bằng cỏch này hạt vừa được bọc PEG là một loại polymer cú tớnh tương thớch sinh học cao, vừa cú nhúm chức năng mong muốn.
Húa chất:
- Precursor: methyltriethoxysilane (MTEOS): CH3-Si-(OC2H5)3, >97%, Merck;
- Aminopropyltriethoxysilane (APTEOS - (C2H5)3-Si-C3H6-NH2), >98% Merck, đồng thời đõy cũng là đồng precursor;
- 3-(trimethoxysilyl)-1 propanthiol (PTTMEOS - (OCH3)3-Si-(CH2)3-SH), ≥95%, Merck;
- Chlorotrimethylsilane (CTMES - C3H9SiCl), ≥ 95%, Sigma-Aldrich;
- Hoạt động bề mặt: Aerosol-OT (AOT): C20H37O7NaS và đồng hoạt động bề mặt Butanone-2: C4H8O (Merck);
- Dimethyl Sulfoxide (DMSO): (CH3)2SO, 99,8% , Merck; - Dung dịch amoniac: NH4OH, 25 – 28 %, Sigma-Aldrich;
- Polyethylene glycol (PEG): SH – PEG – COOH, Creative PEGWorks; - Bovine serum albumin (BSA) - Sigma-Aldrich;
- Streptavidin (SA)- Sigma-Aldrich; - EDC…
- Màng bỏn thấm 10000 Molecular Weight CutOff (MWCO); - Nước khử ion và nước cất hai lần.
a) b) c)
d) e) f)
Hỡnh 2.1. Cấu trỳc húa học của cỏc chất precursor và hoạt động bề mặt
a) MTEOS b) APTEOS c) AOT
d) PTTMEOS e) Butanone-2 f) CTMES
a) Chế tạo và chức năng húa hạt nano silica chứa tõm màu RB với cỏc nhúm
chức năng: NH2 + OH và NH2
Sơ đồ thớ nghiệm được biểu diễn trong Hỡnh 2.2. Đầu tiờn hỗn hợp hoạt động bề mặt gồm AOT và butanone-2 được pha với nhau theo tỉ lệ 0,11 g AOT:200 àl butanone-2 hay tỉ lệ mol là 1:9, sau đú rung siờu õm cho tới khi dung dịch trong suốt về mặt quang học và đồng nhất về mặt húa học. Lấy 1860 àl dung dịch hoạt động bề mặt thu được như trờn cộng với 400 àl MTEOS precursor, khuấy từ cho dung dịch đồng nhất. Tiếp theo, 20 ml nước cất hai lần được thờm vào và khuấy từ 1 giờ để thu được hệ micelle: MTEOS/AOT (butanone-2)/nước. Sau đú 100 àl chất màu RB trong DMSO được cho thờm vào và khuấy từ 10 phỳt để chất màu phõn tỏn đều trong cỏc hệ micelle. Lỳc này sẽ thu được được hệ micelle: MTEOS + chất màu/AOT (butanone-2)/nước, mỗi hệ micelle này sẽ là một trung tõm phản ứng.
Đối với cỏc mẫu đối chứng, 100 àl dung dịch DMSO khụng cú chất màu được thờm vào dung dịch. Cuối cựng cho APTES và khuấy từ trong 20 giờ, ta thu được mẫu hạt silica/ormosil cú cỏc nhúm chức –NH2 và –OH trờn bề mặt. Ở đõy APTES vừa là xỳc tỏc, vừa cung cấp nhúm chức NH2. Để loại bỏ cỏc hợp chất cũn dư trong cỏc phản ứng và loại toàn bộ hoạt động bề mặt AOT và Butanone-2, dung dịch thu được được đưa vào tỳi bỏn thẩm thấu 10000MWCO và được rửa nhiều lần bằng nước cất hai lần (9 - 10 lần), mỗi lần rửa trong thời gian 6 giờ dưới tỏc dụng của mỏy khuấy từ.
Cỏc phương trỡnh phản ứng xảy ra trong quỏ trỡnh tạo hạt nano silica: - Phản ứng thủy phõn
CH3Si(OC2H5)3 + 3H2O →CH3Si(OC2H5)2-x(OH)x+1 + 3C2H5OH (2.1) NH2C3H6Si(OC2H5)3 + 3H2O → NH2C3H6-Si(OC2H5) + 3C2H5OH (2.2)
Hai phản ứng này xảy ra qua nhiều giai đoạn. Cỏc hợp chất trung gian với 1, 2 và 3 nhúm –OH được hỡnh thành liờn tiếp bởi phản ứng ở dạng sau:
CH3Si(OC2H5)3-x(OH)x + H2O →CH3Si(OC2H5)2-x(OH)x+1 + C2H5OH (2.3) NH2C3H6Si(OC2H5)3-x(OH)x + H2O → NH2C3H6-Si(OC2H5)2-x(OH)x+1 + C2H5OH (2.4) Trong đú x là 0, 1, 2
- Phản ứng ngưng tụ:
R-Si(OH)3 + (HO)3-Si-R’ → R(OH)2-Si-O-Si-(OH)2R’ + H2O (2.5) R-Si(OH)3 + (C2H5O)(HO)2-Si-R’ → R(OH)2-Si-O-Si-(OH)2R’ + C2H5OH (2.6) Trong đú: R- và R’- cú thể là CH3- hoặc -C3H6NH2