Chương 1 đó trỡnh bày tổng quan về chất màu hữu cơ, cỏc hạt nano silica chứa chất màu hữu cơ và cỏc đối tượng sinh học liờn quan.
1. Đó trỡnh bày cỏc đặc trưng cơ bản của phõn tử màu hữu cơ như: cấu trỳc húa học, cấu trỳc mức năng lượng, cỏc dịch chuyển quang học. Tớnh chất quang và cỏc đặc trưng cơ bản của huỳnh quang của chất màu hữu cơ và cỏc yếu tố ảnh hưởng cũng được trỡnh bày chi tiết trong phần này.
2. Cỏc hạt nano silica chứa tõm màu hữu cơ được trỡnh bày và nờu bật được những ưu điểm của cỏc hạt nano chứa tõm màu so với cỏc phõn tử màu đơn lẻ.
- Cỏc phương phỏp chế tạo hạt nano silica chứa tõm màu bao gồm: phương phỏp Stober, cỏc phương phỏp micelle (micelle thuận và micelle đảo). Mỗi phương phỏp cú ưu, nhược điểm riờng và phự hợp với từng loại tõm màu.
- Cỏc đặc điểm nổi trội của hạt nano silica chứa phõn tử màu là độ chúi cao, độ bền quang cao, bền trong mụi trường sinh học, dễ dàng thay đổi kớch thước và nhúm chức năng trờn bề mặt hạt, thuận lợi cho việc ứng dụng trong cỏc phõn tớch sinh học.
- Cỏc ứng dụng của hạt nano silica chứa tõm màu trong sinh học với vai trũ là chất đỏnh dấu: hiện ảnh tế bào, phỏt hiện DNA siờu nhạy, đầu dũ đa chức năng, ứng dụng trong mỏy đếm dũng tế bào… và vận chuyển thuốc.
3. Cỏc khỏi niệm cơ bản của cỏc đối tượng sinh học liờn quan sử dụng trong cỏc ứng dụng sinh học như: protein, khỏng nguyờn, khỏng thể, vi khuẩn E. coli
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Cỏc thớ nghiệm chế tạo
2.1.1. Chế tạo cỏc hạt nano silica/ormosil (silica) chứa tõm màu RB bằng phương phỏp micelle thuận phương phỏp micelle thuận
2.1.1.1. Chế tạo và chức năng húa hạt nano silica chứa tõm màu RB
Với mục đớch tạo ra hạt nano silica dạng cầu, phõn tỏn trong nước, kớch thước vài chục nano một, cú cỏc nhúm chức năng như -NH2, -COOH, -SH, -OH trờn bề mặt. Phương phỏp micelle thuận đó được lựa chọn vỡ phương phỏp này cho hạt nano silica phõn tỏn trong nước, sử dụng dung mụi khụng độc (nước), kớch thước hạt cú thể thay đổi theo ý muốn. Cỏc nhúm chức năng được chế tạo theo hai cỏch:
1) Sử dụng precursor cú nhúm chức mong muốn để tạo phản ứng đồng trựng hợp với precursor gốc MTEOS. Nhúm chức này liờn kết trực tiếp với nguyờn tử Si, khụng tham gia vào cỏc quỏ trỡnh thủy phõn và ngưng tụ. Do đú hạt nhận được sẽ gồm một mạng nền silica cú cỏc lỗ xốp với cỏc nhúm chức khỏc nhau trờn bề mặt lỗ xốp và trờn bề mặt hạt. Cỏc phõn tử màu được phõn tỏn trong cỏc lỗ xốp.
2) Chế tạo cỏc hạt nano khụng cú cỏc nhúm chức năng trước, sau đú bọc bằng polyethylene glycol (PEG) với nhúm chức mong muốn. Bằng cỏch này hạt vừa được bọc PEG là một loại polymer cú tớnh tương thớch sinh học cao, vừa cú nhúm chức năng mong muốn.
Húa chất:
- Precursor: methyltriethoxysilane (MTEOS): CH3-Si-(OC2H5)3, >97%, Merck;
- Aminopropyltriethoxysilane (APTEOS - (C2H5)3-Si-C3H6-NH2), >98% Merck, đồng thời đõy cũng là đồng precursor;
- 3-(trimethoxysilyl)-1 propanthiol (PTTMEOS - (OCH3)3-Si-(CH2)3-SH), ≥95%, Merck;
- Chlorotrimethylsilane (CTMES - C3H9SiCl), ≥ 95%, Sigma-Aldrich;
- Hoạt động bề mặt: Aerosol-OT (AOT): C20H37O7NaS và đồng hoạt động bề mặt Butanone-2: C4H8O (Merck);
- Dimethyl Sulfoxide (DMSO): (CH3)2SO, 99,8% , Merck; - Dung dịch amoniac: NH4OH, 25 – 28 %, Sigma-Aldrich;
- Polyethylene glycol (PEG): SH – PEG – COOH, Creative PEGWorks; - Bovine serum albumin (BSA) - Sigma-Aldrich;
- Streptavidin (SA)- Sigma-Aldrich; - EDC…
- Màng bỏn thấm 10000 Molecular Weight CutOff (MWCO); - Nước khử ion và nước cất hai lần.
a) b) c)
d) e) f)
Hỡnh 2.1. Cấu trỳc húa học của cỏc chất precursor và hoạt động bề mặt
a) MTEOS b) APTEOS c) AOT
d) PTTMEOS e) Butanone-2 f) CTMES
a) Chế tạo và chức năng húa hạt nano silica chứa tõm màu RB với cỏc nhúm
chức năng: NH2 + OH và NH2
Sơ đồ thớ nghiệm được biểu diễn trong Hỡnh 2.2. Đầu tiờn hỗn hợp hoạt động bề mặt gồm AOT và butanone-2 được pha với nhau theo tỉ lệ 0,11 g AOT:200 àl butanone-2 hay tỉ lệ mol là 1:9, sau đú rung siờu õm cho tới khi dung dịch trong suốt về mặt quang học và đồng nhất về mặt húa học. Lấy 1860 àl dung dịch hoạt động bề mặt thu được như trờn cộng với 400 àl MTEOS precursor, khuấy từ cho dung dịch đồng nhất. Tiếp theo, 20 ml nước cất hai lần được thờm vào và khuấy từ 1 giờ để thu được hệ micelle: MTEOS/AOT (butanone-2)/nước. Sau đú 100 àl chất màu RB trong DMSO được cho thờm vào và khuấy từ 10 phỳt để chất màu phõn tỏn đều trong cỏc hệ micelle. Lỳc này sẽ thu được được hệ micelle: MTEOS + chất màu/AOT (butanone-2)/nước, mỗi hệ micelle này sẽ là một trung tõm phản ứng.
Đối với cỏc mẫu đối chứng, 100 àl dung dịch DMSO khụng cú chất màu được thờm vào dung dịch. Cuối cựng cho APTES và khuấy từ trong 20 giờ, ta thu được mẫu hạt silica/ormosil cú cỏc nhúm chức –NH2 và –OH trờn bề mặt. Ở đõy APTES vừa là xỳc tỏc, vừa cung cấp nhúm chức NH2. Để loại bỏ cỏc hợp chất cũn dư trong cỏc phản ứng và loại toàn bộ hoạt động bề mặt AOT và Butanone-2, dung dịch thu được được đưa vào tỳi bỏn thẩm thấu 10000MWCO và được rửa nhiều lần bằng nước cất hai lần (9 - 10 lần), mỗi lần rửa trong thời gian 6 giờ dưới tỏc dụng của mỏy khuấy từ.
Cỏc phương trỡnh phản ứng xảy ra trong quỏ trỡnh tạo hạt nano silica: - Phản ứng thủy phõn
CH3Si(OC2H5)3 + 3H2O →CH3Si(OC2H5)2-x(OH)x+1 + 3C2H5OH (2.1) NH2C3H6Si(OC2H5)3 + 3H2O → NH2C3H6-Si(OC2H5) + 3C2H5OH (2.2)
Hai phản ứng này xảy ra qua nhiều giai đoạn. Cỏc hợp chất trung gian với 1, 2 và 3 nhúm –OH được hỡnh thành liờn tiếp bởi phản ứng ở dạng sau:
CH3Si(OC2H5)3-x(OH)x + H2O →CH3Si(OC2H5)2-x(OH)x+1 + C2H5OH (2.3) NH2C3H6Si(OC2H5)3-x(OH)x + H2O → NH2C3H6-Si(OC2H5)2-x(OH)x+1 + C2H5OH (2.4) Trong đú x là 0, 1, 2
- Phản ứng ngưng tụ:
R-Si(OH)3 + (HO)3-Si-R’ → R(OH)2-Si-O-Si-(OH)2R’ + H2O (2.5) R-Si(OH)3 + (C2H5O)(HO)2-Si-R’ → R(OH)2-Si-O-Si-(OH)2R’ + C2H5OH (2.6) Trong đú: R- và R’- cú thể là CH3- hoặc -C3H6NH2
Hỡnh 2.2. Sơ đồ chế tạo hạt nano silica chứa tõm màu RB cú cỏc nhúm chức NH2,
APTES H2O RB/DMSO C 3H 9SiCl AOT, Butanone-2, MTEOS NH2 OH H2N HO NH2 NH2 NH2 H2N NH2 NH2
NH2+OH
- Phản ứng kết hợp và gel húa: Trong quỏ trỡnh ngưng tụ, cỏc hạt polymer nhỏ được tạo thành bởi quỏ trỡnh này sẽ kết hợp với nhau tạo thành cỏc đỏm cú tỷ trọng thấp, chỳng kết tụ với nhau tạo ra khung rắn phõn nhỏnh chiếm thể tớch nhỏ và càng ngày càng lớn dần lờn cho tới khi chiếm toàn bộ khoảng trống trong cỏc micelle.
Như vậy, trong phản ứng tạo hạt nano silica trờn thỡ APTEOS vừa là đồng precursor để tạo nhúm chức -NH2 trờn bề mặt, đồng thời tạo mụi trường bazơ làm xỳc tỏc cho phản ứng ngưng tụ. Sau khi chế tạo, trờn bề mặt cỏc hạt nano thu được tồn tại đồng thời hai nhúm chức năng NH2 (dưới dạng ion NH3+) và OH-, theo thời gian cỏc hạt nano sẽ bị kết đỏm do tương tỏc tĩnh điện giữa cỏc ion NH3+ và OH-. Do đú, để cú thể bảo quản được hạt nano trong thời gian dài, cần loại bỏ nhúm OH-
trờn bề mặt hạt. Trimethylsilyl chloride ((CH3)3–Si–Cl) được sử dụng cho mục đớch trờn. Phản ứng xảy ra như sau:
Hỡnh 2.3. Sơ đồ phản ứng loại bỏ nhúm OH trờn bề mặt hạt NH2+OH
b) Chế tạo và chức năng húa hạt nano silica chứa tõm màu với cỏc nhúm chức năng: OH và SH
Hỡnh 2.4. Sơ đồ chế tạo hạt nano silica cú cỏc nhúm chức –OH và -SH
NH4OH H2O RB/DMSO C 6H 16O 3 SiS AOT, Butanol-2, MTEOS OH OH OH HO OH SH SH SH SH SH (CH3)3–Si–Cl NH2 OH H2N HO NH2 NH2 H2N HO NH2 O-Si-(CH3)3 HCl
Để chế tạo cỏc hạt nano silica cú cỏc nhúm chức năng –OH, NH4OH được thay thế cho APTEOS làm xỳc tỏc trong quỏ trỡnh ngưng tụ. Để tạo hạt nano silica cú nhúm chức –SH, 3-trimethoxysilyl-1 propanthiol (C6H16O3SiS) đó được thờm vào để đồng trựng hợp với MTEOS. Sơ đồ chế tạo cỏc hạt nano cú nhúm chức –OH và –SH được trỡnh bày trong Hỡnh 2.4
Phản ứng tạo nhúm -SH trờn bề mặt hạt được mụ tả trờn Hỡnh 2.5.
Hỡnh 2.5. Phương trỡnh phản ứng tạo nhúm –SH trờn bề mặt hạt nano
c) Bọc hạt nano silica bằng PEG đồng thời tạo nhúm chức -COOH
Mục đớch để chế tạo được cỏc hạt nano silica đơn phõn tỏn hơn, ổn định theo thời gian và thuận lợi cho việc ứng dụng gắn kết với phõn tử sinh học, chỳng tụi tiến hành bọc HS-PEG-COOH (PEG) cho hạt nano silica. Kết quả sẽ nhận được hạt nano silica vừa cú lớp bọc PEG vừa cú nhúm chức hợp sinh -COOH trờn bề mặt. PEG cú cụng thức phõn tử như Hỡnh 2.6.
Hỡnh 2.6. Cấu trỳc phõn tử SH – PEG – COOH
Quy trỡnh bọc PEG: Sau khi chế tạo được hạt nano silica với xỳc tỏc sử dụng là APTEOS (chưa rửa hoạt động bề mặt), PEG được bọc lờn hạt. Hũa tan PEG trong 100àl DMSO bằng rung siờu õm và vortex tới khi dung dịch trong suốt và đồng nhất. Sau đú cho 20 àl precursor PTTMEOS vào để phản ứng xảy ra trong 2 giờ. Dung dịch thu được sẽ được cho vào dung dịch hạt nano silica ở trờn và khuấy từ liờn tục 8 giờ ở nhiệt độ phũng. Kết quả thu được hạt nano silica vừa cú lớp bọc PEG vừa cú nhúm chức –COOH trờn bề mặt.
Phương trỡnh phản ứng: Khi cho PEG vào dung dịch precursor PTTMEOS, hai phõn tử này sẽ nối với nhau bằng cầu disulfide S-S.
(OCH3)3-Si-(CH2)3-SH + HS-PEG-COOH → (OCH3)3-Si-(CH2)3-S-S-PEG-COOH + H2 (2.7)
OH CH3OH + + Si OH OH OH Si OCH3 (CH2)3 OCH3 OCH3 SH Si OH O Si OCH3 (CH2)3 OCH3 SH
Khi cho dung dịch trờn vào dung dịch hạt nano sử dụng xỳc tỏc APTEOS, precursor PTTMEOS sẽ thủy phõn và sau đú sẽ kết hợp với cỏc nhúm –OH trờn bề mặt hạt nano/APTEOS để tạo thành một lớp silica thờm lờn hạt với cỏc phõn tử PEG bao quanh cú nhúm COO- trờn bề mặt.
Tớnh toỏn lượng PEG dựng để bọc hạt silica:
Giả sử nếu một phõn tử PTTMEOS phản ứng với một phõn tử PEG thỡ số phõn tử PTTMEOS bằng số phõn tử PEG. Như vậy cần một khối lượng PEG khỏ lớn, mà PEG cú giỏ thành cao nờn chỳng tụi khụng bọc đủ PEG theo số liệu tớnh toỏn. PEG được bọc theo tỉ lệ mol PEG:PTTMEOS là 8:100.
2.1.1.2. Bọc hạt nano silica bằng protein
a) Bọc hạt nano silica bằng bovine serum albumin (BSA)
Cỏc dung dịch hạt silica cú nhúm chức -NH2, -OH, -SH chế tạo theo cỏch trờn thường hơi cú tớnh axit với pH khoảng từ 5 đến 6, do đú dung dịch này thường bị vẩn đục trong cỏc mụi trường cú tớnh bazơ hoặc trung tớnh do cỏc hạt silica bị kết đỏm. Vấn đề đặt ra là phải làm sao để cỏc hạt này cú thể sử dụng được trong cỏc mụi trường cú pH khỏc nhau. Phương ỏn bọc BSA được lựa chọn do tiếp thu cỏc kết quả bọc hạt nano vàng của nhúm nghiờn cứu [131]. Nhờ được bọc BSA, cỏc hạt nano silica sau khi chế tạo sẽ ổn định hơn rất nhiều. Hơn nữa, việc bọc vỏ BSA sẽ tạo ra mụi trường thuận lợi để hạt silica tồn tại trong cơ thể sống phục vụ cho mục đớch nhận biết khối u sau này.
Hỡnh 2.7. Sơ đồ minh họa quỏ trỡnh bọc BSA lờn hạt nano silica
Mẫu được chọn để bọc BSA là hạt nano silica cú nhúm chức -OH trờn bề mặt.
Quy trỡnh bọc hạt: Pha BSA trong dung dịch đệm MES (axit 2-(N- morpholino)etansulfonic), khuấy từ trong 30 phỳt. BSA pha trong MES được đưa vào dung dịch nano silica sau khi đó chế tạo xong. Hỗn hợp nano silica - BSA trong MES được khuấy từ khoảng 30 phỳt ở 40C cho tới khi dung dịch trở nờn trong suốt. Sau đú để ổn định trong tối ở 40C trong thời gian 1-2 ngày. BSA được hấp phụ trực tiếp lờn bề mặt hạt nano silica.
Với mục đớch tỡm lượng BSA đủ để bọc kớn hạt, một dóy 16 mẫu với lượng BSA khỏc nhau đó được chế tạo (Bảng 2.1)
Bảng 2.1. Thớ nghiệm xỏc định lượng BSA đủ để bọc hạt
STT BSA (mg) BSA (MES) (μl) SiO2 -OH (ml) MES (μl) 1. 0,0 0 1 150 2. 0,1 10 1 140 3. 0,2 20 1 130 4. 0,3 30 1 120 5. 0,4 40 1 110 6. 0,5 50 1 100 7. 0,6 60 1 90 8. 0,7 70 1 80 9. 0,8 80 1 70 10. 0,9 90 1 60 11. 1,0 100 1 50 12. 1,1 110 1 40 13. 1,2 120 1 30 14. 1,3 130 1 20 15. 1,4 140 1 10 16. 1,5 150 1 0
Mẫu sau khi chế tạo được chia làm 2 phần, một phần cho vào trong mụi trường nước và phần cũn lại cho vào mụi trường PBS 4,5X (là hỗn hợp dung dịch gồm NaCL (0,15 M) 87,0g; KH2PO4 2,0g; Na2HPO4 29,0g; NaN3 2,0g pha trong 4,5 lớt nước cất). Sau 24 giờ, cỏc mẫu được đo phổ hấp thụ và huỳnh quang.
b) Bọc hạt nano silica bằng Streptavidin (SA)
Xuất phỏt từ yờu cầu gắn kết hạt nano lờn cỏc phõn tử sinh học khỏc nhau đó được biotin húa (vớ dụ DNA), thớ nghiệm bọc SA lờn hạt nano silica đó được thực hiện.
Cú hai cỏch bọc SA: trực tiếp và giỏn tiếp. Hạt nano silica được sử dụng để bọc SA cú nhúm chức –OH (SiO2-OH), kớch thước trung bỡnh 110 nm.
- Bọc trực tiếp: SA được hấp phụ trực tiếp lờn bề mặt hạt SiO2-OH.
- Bọc giỏn tiếp: Đầu tiờn bọc hạt silica với BSA (SiO2@BSA). Sau đú kớch hoạt nhúm –COOH của SA bằng EDC nhằm tỏc dụng với cỏc nhúm –NH2 trờn BSA. Gắn kết SA đó kớch hoạt với SiO2@BSA thụng qua liờn kết amide được mụ tả trờn Hỡnh 2.8 và Hỡnh 2.9.
Hỡnh 2.9. Mụ hỡnh quỏ trỡnh bọc SA bằng cỏch trực tiếp (a) và giỏn tiếp (b)
- Tớnh toỏn lượng SA dựng để bọc hạt nano silica:
Ta cú diện tớch bề mặt một hạt SiO2-OH trung bỡnh là: *d*d = 38013 nm2. Diện tớch bề mặt một phõn tử SA là 50 nm2. Để bọc kớn một hạt SiO2-NH2 cần khoảng 760 phõn tử SA. Tuy nhiờn do SA cú giỏ thành cao nờn chỳng tụi khụng bọc kớn SA theo số liệu tớnh toỏn, mà chỉ đớnh 50 phõn tử SA trờn một hạt SiO2-OH. Cỏc vị trớ cũn trống sẽ được bọc bằng BSA (thụ động húa cỏc vị trớ cũn dư bằng BSA là cỏch thường dựng trong sinh học)
+ Bọc trực tiếp:
- Lấy 0,5 mg SA pha trong 500 àl MES 0,01M vortex cho tan; lấy 30 àl SA pha trong MES cho vào 1ml SiO2-OH (nồng độ 7.1012hạt/ml) ủ lắc 2 giờ trong tối.
- Cho 1,5 mg BSA vào dung dịch trờn, khuấy từ 30 phỳt rồi để ở 40C trong 24 giờ.
+ Bọc giỏn tiếp
Hỡnh 2.8. Phương trỡnh phản ứng tạo liờn kết amide
+ a)
- Bọc BSA cho hạt SiO2-OH với quy trỡnh như bọc BSA ở phần trờn.
- Pha 0,1 mg EDC trong 10 àl H2O vortex cho tan sau đú cho vào 30 àl SA pha trong MES ủ lắc 15 phỳt ở 4oC. Cho dung dịch SA vào dung dịch SiO2- OH@BSA ủ lắc trong 2 giờ, ở 4oC trong tối.
2.1.1.3. Chế tạo mẫu cho nghiờn cứu tớnh chất quang lý
Hai dóy mẫu silica chứa tõm màu RB được chế tạo nhằm mục đớch nghiờn cứu tớnh chất quang lý của cỏc tõm màu trong nền silica.
a) Cỏc mẫu với cỏc nhúm chức khỏc nhau
Để chế tạo cỏc hạt nano silica với cỏc nhúm chức năng khỏc nhau trờn bề mặt, cỏc mẫu được chế tạo với cựng lượng precursor, hoạt động bề mặt, nước và lượng xỳc tỏc (APTES hoặc NH4OH) như trong Bảng 2.2
Bảng 2.2. Dóy mẫu thay đổi nhúm chức năng
Mẫu AOT (g) Bu- 2 (àl) H2O (ml) MTEOS (àl) NH4OH (àl) APTEOS (àl) SiO2-NH2&OH 0,44 800 20 400 - 30 SiO2-NH2 0,44 800 20 400 - 30 SiO2-COOH 0,44 800 20 400 - 30 SiO2-SH 0,44 800 20 400 30 -
Cỏc mẫu sau đú được chức năng húa với cỏc nhúm chức năng theo quy trỡnh đó trỡnh bày trong mục 2.1.1.1