Để kiểm tra xem cỏc hạt nano silica cú khả năng gắn kết với tế bào hay khụng, chỳng tụi tiến hành ủ tế bào KPL4 (biểu hiện thụ thể HER2) và Hela (khụng biểu hiện thụ thể HER2) với cỏc hạt nano silica bọc BSA (SiO2RB@BSA) và phức hệ khỏng thể HER2 - hạt nano silica (SiO2RB@HER2). Hỡnh 4.5 là ảnh huỳnh quang của tế bào KPL4 ủ sống với phức hệ SiO2RB@HER2 (Hỡnh 4.5.A) và với SiO2RB@BSA (Hỡnh 4.5.B). Trờn ảnh hiển vi huỳnh quang (Hỡnh 4.5.A) chỳng ta cú thể thấy cỏc hạt silica (màu đỏ) tập trung trờn cả màng và vựng xung quanh nhõn của tế bào KPL4. 0.0 3.0x104 6.0x104 9.0x104 Số lượ ng v i khuẩ n (C FU )
Phương pháp đếm Phương pháp phổ huỳnh quang
Hỡnh 4.4. So sỏnh hai phương phỏp phỏt hiện
vi khuẩn: phương phỏp đếm khuẩn lạc (trỏi) và phương phỏp phổ huỳnh quang (phải)
Hỡnh 4.5. Ảnh huỳnh quang tế bào KPL4 ủ sống với phức hệ SiO2RB@HER2 (A) và với SiO2RB@BSA (B)
Để kiểm tra liệu hạt nano silica tự do cú khả năng bỏm khụng đặc hiệu lờn bề mặt màng khụng chỳng tụi sử dụng mẫu đối chứng là hạt SiO2RB@BSA (chỉ cú nano silica bọc BSA, khụng cú khỏng thể). Ảnh đối chứng Hỡnh 4.5.B và Hỡnh 4.6.B cho thấy gần như khụng cú silica bỏm trờn tế bào KPL4 và HeLa, nghĩa là cỏc hạt SiO2RB@BSA tự do khụng cú khả năng gắn lờn màng tế bào. Mặt khỏc, cỏc tế bào HeLa sống ủ trực tiếp với SiO2RB@HER2 cũng khụng biểu hiện huỳnh quang kể cả trờn màng hay bờn trong tế bào. Điều này là do ở tế bào HeLa khụng biểu hiện thụ thể HER2, nờn phức hệ SiO2RB@HER2 khụng thể gắn lờn bề mặt tế bào.
Hỡnh 4.6. Ảnh huỳnh quang tế bào HeLa sống ủ với phức hệ SiO2RB@HER2 (A) và
với SiO2RB@BSA (B)
Tuy nhiờn, một cõu hỏi đặt ra là, liệu cỏc hạt silica bỏm trờn tế bào KPL4 cú duy trỡ mối liờn kết đỳng với khỏng thể khỏng thụ thể HER2 trờn tế bào hay chỉ hấp phụ trờn bề mặt tế bào? Để trả lời cõu hỏi trờn chỳng tụi tiến hành thớ nghiệm tiếp theo trờn cỏc tế bào đó được cố định.
Hỡnh 4.7. Ảnh huỳnh quang tế bào KLP4 cố định ủ với phức hệ SiO2RB@HER2
Tế bào KPL4 và HeLa sau khi cố định, được ủ với phức hệ SiO2RB@ HER2, nhuộm với khỏng thể 2-M488, Hỡnh 4.7 là hỡnh ảnh quan sỏt dưới kớnh hiển vi huỳnh quang. Nhỡn trờn ảnh hiển vi huỳnh quang cú thể thấy rừ phức hệ SiO2RB@HER2 tập trung chủ yếu ở xung quanh màng tế bào.
Để khẳng định chắc chắn khụng cú nano silica tự do cú bỏm ngẫu nhiờn lờn tế bào, chỳng tụi đó sử dụng khỏng thể 2-M488 để kiểm tra vị trớ của silica so với khỏng thể tỏi tổ hợp (Khỏng thể 2-M488 sẽ bỏm đặc hiệu vào khỏng thể tỏi tổ hợp HER2).
Hỡnh 4.8. Ảnh huỳnh quang kết hợp tế bào KPL4 và Hela cố định ủ với phức hệ
SiO2RB@HER2, nhuộm khỏng thể 2-M488
A: Tế bào KPL4 cố định ủ với khỏng thể SiO2RB@HER2, nhuộm khỏng thể 2-M488 B: Tế bào HeLa cố định ủ với khỏng thể SiO2RB@HER2, nhuộm khỏng thể 2-M488
Ở ảnh huỳnh quang kết hợp ở hỡnh 4.8.A chỳng ta thấy vị trớ của khỏng thể 2-M488 (màu xanh) trựng với vị trớ của phức hệ SiO2RB@HER2 (màu đỏ) tạo nờn những vựng ảnh kết hợp màu cam. Điều này chứng minh hầu như khụng cú hạt slica
tự do bỏm ngẫu nhiờn trờn tế bào, màu silica trờn ảnh huỳnh quang đều là màu của silica liờn kết với khỏng thể. Ở hỡnh 4.8.B là cỏc tế bào HeLa, do khụng cú khỏng thể đặc hiệu HER2 trờn màng tế bào nờn khi ủ với phức hệ SiO2RB@HER2 sẽ khụng cú hiện tượng bắt màu huỳnh quang.
Để xỏc định thời gian gắn tối ưu của tế bào ung thư KPL4 với phức hệ SiO2RB@HER2, chỳng tụi tiến hành ủ trong 4 khoảng thời gian khỏc nhau: 1,5 giờ, 3 giờ, 6 giờ và 16,5 giờ. Ảnh huỳnh quang thu được khi ủ tế bào với khỏng thể phức hệ SiO2RB@HER2 tại 4 khoảng thời gian khỏc nhau được thể hiện ở Hỡnh 4.9.
Quan sỏt ảnh hiển vi huỳnh quang Hỡnh 4.9 ta nhận thấy tại thời điểm 3 giờ từ khi ủ với phức hệ SiO2RB@HER2, tế bào phỏt huỳnh quang mạnh nhất. Cường độ phỏt huỳnh quang giảm ở thời điểm 6 giờ và thấp nhất ở thời điểm 16.5 giờ. Điều này được giải thớch là do tại thời điểm 3 giờ tỉ lệ phức hệ SiO2RB@HER2 bỏm lờn bề mặt tế bào là cao nhất, và số lượng khỏng thể bị nhập bào là thấp nhất. Ở cỏc khoảng thời gian lớn hơn, khỏng thể bị đưa vào tế bào và xảy ra hiện tượng nhập bào với phức hệ SiO2RB@HER2. Sau khi bị nhập bào, phức hệ SiO2RB@HER2 bị phõn giải. Cường độ huỳnh quang ở thời điểm 1,5 giờ khỏ yếu được giải thớch là do thời gian 1,5 giờ là chưa đủ cho phức hệ SiO2RB@HER2 bỏm lờn bề mặt tế bào với số lượng đủ lớn.
Hỡnh 4.9. Ảnh huỳnh quang tế bào KPL4 ủ với phức hệ SiO2RB@HER2 ở 4 khoảng
thời gian khỏc nhau