1.2.1. Cỏc hạt nano silica và latex
Hạt nano silica và latex (polystyrene) là cỏc hạt nano chứa tõm màu. Dựa trờn nền hạt là silica hay polymer người ta chia thành hạt nano silica và hạt nano polymer hay hạt latex [24,52,57,77,78]. Chất màu cú thể được gắn trờn bề mặt hoặc đưa vào bờn trong hạt nano silica hay latex [93]. So với cỏc chất màu hữu cơ thỡ cỏc hạt nano này cú độ bền quang cao hơn vỡ nền polymer và silica bảo vệ cỏc chất màu hữu cơ khỏi oxy hoỏ và phõn hủy quang. Độ chúi của tớn hiệu huỳnh quang của của cỏc hạt nano silica và latex cú thể được điều khiển bằng số phõn tử chất màu trong mỗi hạt với mật độ chất màu lớn nhất được giới hạn chỉ bởi sự dập tắt huỳnh quang. Vỡ vậy, hạt nano silica và latex cú độ bền quang tương đối tốt và khụng nhấp nhỏy [24,52,57,77,78]. Vớ dụ, cỏc chất màu pyrene trong hạt polystyrene cú cường độ huỳnh quang cao gấp hơn 40 lần ở trong dung mụi. Những ưu điểm nổi bật này làm cho chỳng cú ứng dụng rất lớn trong phõn tớch sinh học.
So sỏnh với cỏc hạt nano polymer, cỏc hạt nano silica cú một vài ưu điểm. Cỏc hạt silica dễ dàng tạo đơn hạt hơn trong quỏ trỡnh chế tạo do cỏc hạt latex cú hiện tượng khụng mong muốn là kết đỏm. Hơn nữa, cỏc hạt silica với nhúm –OH trờn bề mặt cú thể tham gia phản ứng hoỏ học để tạo cỏc nhúm chức cú khả năng liờn kết đặc hiệu với cỏc phõn tử sinh học như là amin (-NH2), carboxyl (-COOH) hay thiol (-SH). Trong khi
đú, cỏc hạt latex cú tớnh kỵ nước làm cho việc gắn kết với cỏc phõn tử sinh học trở nờn phức tạp. Để khắc phục những nhược điểm này, cỏc lừi kỵ nước của hạt latex được yờu cầu bọc thờm cỏc vỏ ưa nước polymer như polyethylene glycol (PEG), protein như bovine serum albumin (BSA). Thờm vào đú, độ pH của mụi trường thay đổi khụng làm cỏc hạt silica bị phồng lờn (swelling) và thay đổi độ xốp (porosity change), trong khi đú cỏc hạt latex bị phồng làm cho cỏc chất màu bị thoỏt ra ngoài [89]. Vỡ vậy, cỏc hạt silica nằm trong thế hệ cỏc chất đỏnh dấu sinh học mới.
Hỡnh 1.7. Sự phỏt xạ huỳnh quang của cỏc hạt nano silica chứa cỏc loại tõm
màu khỏc nhau
1.2.2. Cỏc hạt nano silica/ormosil
Trong những năm gần đõy, cỏc hạt nano silica/ormosil (organically modified silicate) được sử dụng rộng rói trong cỏc ứng dụng y - sinh học như truyền tải gen như một chất mang DNA, chất mang thuốc trong trị liệu quang động học PDT (Photodynamic Therapy) và cỏc lĩnh vực quang tử khỏc [72,96,98,111,160]. So với cỏc hạt nano silica, cỏc hạt nano silica/ormosil cú vài ưu điểm: mặc dự nền thủy tinh silica trong suốt về mặt quang học nhưng do được chế tạo bằng phương phỏp sol- gel nờn cú nhược điểm là cú nhiều lỗ xốp nờn tớnh đồng nhất quang học khụng cao,
Hỡnh 1.6. Cỏc cỏch phổ biến kết hợp tõm
và dễ bị ra màu. Để khắc phục nhược điểm này, người ta dựng nền ormosil là nền thủy tinh sol-gel cú chứa thành phần hữu cơ liờn kết với nguyờn tử Si bằng liờn kết bền vững – liờn kết cộng húa trị. Nền loại này được điều chế bằng phương phỏp sol- gel từ cỏc alkoxysilic cú chứa một nhúm hữu cơ liờn kết với Si bằng liờn kết bền (Si-C) khụng bị phõn li trong quỏ trỡnh thủy phõn. Vật liệu nhận được gồm khung SiO2mà mỗi nguyờn tử Si đều gắn với một nhúm nguyờn tử hữu cơ nằm trờn bề mặt cỏc lỗ xốp vỡ vậy làm giảm mạnh sự thoỏt của cỏc phõn tử chất màu ra khỏi cỏc hạt silica. Nhúm nguyờn tử hữu cơ cú chiết suất gần với chiết suất của thủy tinh làm giảm sự tỏn xạ quang trong cỏc lỗ xốp. Do đú, nền ormosil cú tớnh đồng nhất quang học cao. Người ta thường dựng vinyl triethoxysilane (VTEOS) cú cụng thức CH2=CH-Si-(OC2H5)3, methyl triethyoxysilane (MTEOS) cú cụng thức CH3-Si- (OC2H5)3, methyl trimethoxysilane (MTMOS) cú cụng thức CH3-Si-(OCH3)3 để tạo nền ormosil [1].
Mặt khỏc, cỏc hạt silica/ormosil sử dụng trong cỏc ứng dụng sinh học thường được tạo cỏc nhúm chức năng amine, carboxyl hay thiol bằng cỏch sử dụng cỏc precursor cú cỏc nhúm hữu cơ NH2, COOH hay SH liờn kết với Si trong phản ứng đồng trựng hợp với TEOS hoặc MTEOS.
1.2.3. Phương phỏp chế tạo hạt nano silica chứa tõm màu hữu cơ
Cỏc hạt nano silica chứa màu hữu cơ thường được tạo ra theo ba phương phỏp sau:
- Phương phỏp Stober
- Phương phỏp micelle thuận - Phương phỏp micelle đảo
Cỏc phương phỏp này đều dựa trờn quỏ trỡnh sol-gel là quỏ trỡnh thủy phõn và ngưng tụ của alkoxit silic để tạo thành mạng silica vụ định hỡnh và phõn tử màu được phõn tỏn trong cỏc lỗ xốp của hạt. Tựy vào kớch thước và bản chất của phõn tử màu mà phương phỏp chế tạo được lựa chọn.
1.2.3.1. Phương phỏp Stober
Phương phỏp Stober được phỏt minh đầu tiờn vào năm 1968 bởi nhà khoa học tờn là Werner Stober, trường đại học Rochester, New York [146]. Phương phỏp này đưa ra quy trỡnh tổng hợp hạt silica đơn phõn tỏn bằng quỏ trỡnh sol – gel, tức là phản ứng thủy phõn và ngưng tụ của cỏc alkoxyde silic được pha loóng ở nồng độ thấp trong dung mụi nước và chất đồng dung mụi như acetone, ethanol, propanol và
n-butanol hoặc trong hỗn hợp cỏc rượu cũng như trong cỏc ờte với xỳc tỏc là ammonia ở pH cao. Trong điều kiện loóng cao của cỏc precursor, cỏc hạt silica hỡnh thành thay thế cho cỏc mạng gel rắn. Kớch thước hạt cú thể điều khiển trong khoảng từ 50 nm tới 2 àm bằng cỏch thay đổi nồng độ ammonia và tỷ lệ alkoxyde và nước [146].
Phản ứng thủy phõn và ngưng tụ cú thể viết ngắn gọn dưới dạng sau: - Phản ứng thủy phõn:
Si(OC2H5)4 + 4H2O → Si(OH)4 + 4C2H5OH (1.9) - Phản ứng ngưng tụ:
Si(OH)4 → SiO2 + 2H2O (1.10)
Phương phỏp này khụng cần dựng chất hoạt động bề mặt cũng như dung mụi sử dụng khụng độc và dễ dàng thay đổi.
1.2.3.2. Cỏc phương phỏp micelle
Phương phỏp Stober rất thớch hợp cho việc tạo ra hạt nano silica cú kớch thước lớn. Để tạo ra cỏc hạt nano silica cú kớch thước nhỏ hơn 50 nm và cú thể kiểm soỏt được kớch thước, cỏc hệ micelle đảo và micelle thuận được sử dụng.
a) b)
Hỡnh 1.8. Cỏc hệ micelle: Hệ micelle thuận (a) và Hệ micelle đảo (b)
Micelle là hệ gồm 3 thành phần: chất hoạt động bề mặt, nước và dung mụi [44,64,108]. Trong đú, chất hoạt động bề mặt là chất mà phõn tử cú hai đầu gồm một đầu kỵ nước và một đầu ưa nước. Do đú, tựy thuộc vào pha của hệ là nhiều nước hay nhiều dung mụi mà sẽ hỡnh thành cỏc hệ micelle thuận hay đảo. Trong hệ micelle thuận hay cũn gọi là vi nhũ dầu trong nước (oil in water) thỡ đầu ưa nước của chất hoạt động bề mặt quay ra ngoài, đầu kỵ nước quay vào trong, mụi trường bờn ngoài là nước, trong micelle là dung mụi. Ngược lại hệ micelle đảo hay vi nhũ
Đầu ưa nước
Nước
Đuụi kỵ nước
Đầu ưa nước
Đuụi kỵ nước Dung mụi
nước trong dầu (water in oil) thỡ đầu kỵ nước quay ra ngoài, đầu ưa nước quay vào trong, mụi trường bờn trong vi nhũ là nước, bờn ngoài là dung mụi (Hỡnh 1.8) [165]. Người ta sử dụng cỏc hệ vi nhũ này để chế tạo cỏc hạt nano, trong đú cỏc hệ micelle chớnh là cỏc trung tõm phản ứng nano (nanoreactor). Cỏc quỏ trỡnh thủy phõn và ngưng tụ của precursor silic (vớ dụ như: TEOS, MTEOS) sẽ xảy ra trong lũng cỏc hệ micelle này. Ứng với hai hệ micelle thuận và đảo ta cú hai phương phỏp chế tạo tương ứng là phương phỏp micelle thuận và phương phỏp micelle đảo. Phương phỏp micelle đảo dựng để chế tạo cỏc hạt nano chứa cỏc tõm màu cú tớnh tan trong nước, cũn phương phỏp micelle thuận thường được sử dụng cho cỏc tõm màu khụng tan trong nước. Kớch thước của cỏc hạt nano được xỏc định bởi bản chất của chất hoạt động bề mặt, loại và lượng precursor, tỷ lệ dung mụi/nước, xỳc tỏc…
Hai phương phỏp chế tạo micelle thuận và micelle đảo cú một số đặc điểm sau: phương phỏp micelle thuận đơn giản hơn, cỏc hạt nano phõn tỏn trong nước ngay sau khi chế tạo và dung mụi là nước hoặc ethanol khụng độc. Phương phỏp micelle đảo cú mụi trường là dung mụi kỵ nước, vỡ vậy sau khi chế tạo cần thờm một bước làm cỏc hạt nano phõn tỏn trong nước. Cỏc hạt chế tạo bằng cỏc phương phỏp micelle thường đồng đều cao về kớch thước, đơn phõn tỏn (monodisperse) [60,85,133,141].
Hỡnh 1.9 là ảnh SEM của cỏc hạt nano silica thực hiện bởi nhúm tỏc giả Paras N. Prasad [52], cỏc hạt đồng đều và đơn phõn tỏn với cỏc kớch thước khỏc nhau. Bằng cỏch tăng lượng chất hoạt động bề mặt thỡ kớch thước hạt nano silica tăng và kớch thước này cũng tăng tương ứng với sự tăng của lượng precursor.
Hỡnh 1.9. Ảnh SEM của cỏc mẫu hạt silica đơn phõn tỏn với cỏc kớch thước khỏc
nhau [52].
1.2.4. Cỏc đặc trưng húa lý
1.2.4.1. Vật liệu nền
Hạt nano silica là hạt nano trờn cơ sở nền silica chứa cỏc tõm màu, được chế tạo bằng phương phỏp sol-gel. Tõm màu trong nền silica được phõn tỏn trong cỏc lỗ
xốp của nền. Vỡ vậy nền silica cú hai vai trũ: thứ nhất là phõn tỏn tõm màu, thứ hai là bảo vệ tõm màu khỏi sự xõm nhập của mụi trường bờn ngoài và khỏi sự phõn hủy quang khi cú ỏnh sỏng kớch thớch. Do nền này cú nồng độ oxy tự do thấp hơn 3 bậc so với dung mụi, làm giảm thiểu sự phõn hủy quang đó được trỡnh bày ở mục 1.1.4 [24,52,57,72,78]. Do đú chất lượng nền là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới độ bền quang – phẩm chất vượt trội của hạt nano silica trong vai trũ là chất đỏnh dấu huỳnh quang.
1.2.4.2. Độ chúi và độ bền quang
a) Độ chúi
Cỏc hạt nano silica cú độ chúi rất cao do chỳng cú thể chứa một lượng lớn cỏc phõn tử màu bờn trong nền silica, vỡ vậy cường độ huỳnh quang của một hạt nano silica núi chung cú thể lớn gấp tới hàng nghỡn lần cường độ huỳnh quang của một phõn tử màu cựng chất trong dung mụi [52,57,72,78]. Đặc biệt, độ chúi này cú thể điều khiển được bằng sự thay đổi số phõn tử chất màu trong mỗi hạt nano silica, với mật độ chất màu lớn nhất được giới hạn chỉ bởi sự dập tắt huỳnh quang. Độ chúi cao này làm cho hạt nano silica chứa tõm màu đặc biệt thớch hợp cho cỏc phõn tớch sinh học yờu cầu độ nhạy cao mà khụng cần thờm cỏc chất tăng nhạy (reagent) hoặc cỏc bước khuếch đại tớn hiệu. Khi cỏc hạt nano pha chất màu được sử dụng như đầu dũ, việc nhận biết phõn tử sinh học được lấy tớn hiệu bằng một hạt nano tớch hợp hàng trăm đến hàng nghỡn phõn tử chất màu làm tăng mạnh tớn hiệu huỳnh quang so với việc sử dụng một phõn tử màu, cú thể gọi đú là hiệu ứng khuếch đại tớn hiệu. Việc tăng tớn hiệu này làm cho cỏc phộp phõn tớch trở nờn rất nhạy cho phộp theo dừi được cỏc quỏ trỡnh đơn phõn tử, điều khụng thể làm được với cỏc kỹ thuật đỏnh dấu huỳnh quang sử dụng cỏc phõn tử thụng thường.
b) Độ bền quang
Độ bền quang là một chỉ số đặc biệt quan trọng đối với việc sử dụng cỏc hạt nano vào ứng dụng trong sinh học. Cỏc phộp đo và quan sỏt trong sinh học thường diễn ra trong khoảng thời gian dài để cú thể theo dừi sự thay đổi của tế bào.
Như đó trỡnh bày trong phần 1.2.4.1, nền silica cú vai trũ như một lớp vỏ bảo vệ chất màu khỏi sự phõn hủy quang do oxy húa, do đú cỏc tõm màu chứa trong cỏc hạt silica cú độ bền quang lớn hơn nhiều so với những chất màu truyền thống tương ứng trong cựng một điều kiện. Điều này làm cho cỏc hạt nano silica chứa tõm màu rất phự hợp cho cỏc ứng dụng mà yờu cầu được kớch thớch với cường độ cao hoặc kộo dài.
Hỡnh 1.10. Tớnh chất của RuBpy pha trong hạt nano silica [27].
(a) Ảnh AFM của hạt nano silica chứa chất màu RuBpy chế tạo bằng phương phỏp micelle đảo, hạt cú đường kớch là 65±2 nm.
(b) Phõn bố kớch thước hạt silica, đường kớnh trung bỡnh hạt là 63.8 nm.
(c) Độ bền quang của RuBpy trong hạt nano silica so với chất màu RuBpy và FITC trong nước. Phộp đo này được kớch thớch bằng laser Argon/Krypton.
Hỡnh 1.10 (c) cho thấy, sau khi kớch thớch bằng laser Argon/Krypton 0,5W trong thời gian 80 s thỡ cường độ huỳnh quang của chất màu RuBpy và FITC giảm đến dưới 20%, trong khi cường độ huỳnh quang của RuBpy trong hạt silica vẫn duy trỡ ở mức 80% so với ban đầu [27].
c) Độ bền trong mụi trường sinh học
Vỡ nền silica cú tớnh trơ về mặt húa học nờn mụi trường sinh học (như dung mụi, cỏc chất tan trong dung dịch đệm…) khụng ảnh hưởng đến cỏc tõm màu chứa trong đú. Cỏc phõn tử màu được sử dụng trực tiếp trong cỏc ứng dụng sinh học thường bị phõn hủy do tỏc động của cỏc mụi trường bờn trong tế bào sống. Trong khi đú sự thay đổi độ pH của mụi trường cũng khụng làm hạt nano silica bị biến dạng, chỳng khụng bị tấn cụng bởi vi khuẩn, khụng bị trương phồng hoặc thay đổi độ xốp. Do đú, nền silica cũng cỏch ly cỏc phõn tử màu khỏi tỏc động của mụi trường sinh húa phức tạp bờn ngoài trong cỏc ứng dụng sinh học [52,57,72,78].
1.2.4.3. Thế Zeta
Thế Zeta là một thuật ngữ khoa học cho thế điện động trong hệ thống keo. Trong cỏc tài liệu húa keo, nú thường được ký hiệu bằng cỏch sử dụng từ Zeta Hy Lạp ( ζ ). Từ quan điểm lý thuyết, thế Zeta là điện thế giữa bề mặt hai lớp (DL) ở vị trớ mặt trượt so với một điểm trong khối chất lỏng ngoài giao diện. Núi cỏch khỏc, thế Zeta là hiệu điện thế giữa mụi trường phõn tỏn và lớp ổn định của chất lỏng gắn liền với hạt được phõn tỏn. Tầm quan trọng của thế Zeta là giỏ trị của nú liờn quan
đến sự ổn định của cỏc hạt keo trong mụi trường phõn tỏn. Thế Zeta cho thấy mức độ của lực đẩy giữa cỏc hạt tớch điện giống nhau liền kề trong mụi trường phõn tỏn.
Bảng 1.1. Độ ổn định của huyền phự theo thế Zeta
Thế Zeta [mV] Độ ổn định của huyền phự
Từ 0 đến ±5 Đụng đặc và vún cục nhanh Từ ±10 đến ±30 Bắt đầu mất ổn định
Từ ±30 đến ±40 Ổn định vừa phải Từ ±40 đến ±60 Ổn định tốt Độ lớn của thế Zeta đo được cú
thể dựng để phỏng đoỏn khoảng thời gian ổn định và khả năng phõn tỏn của cỏc hạt trong dung dịch. Nếu cỏc phõn tử hay hạt trong huyền phủ đủ nhỏ và cú thế Zeta õm hoặc dương cao, chỳng sẽ đẩy nhau và khụng cú xu hướng kết dớnh giữa cỏc hạt. Nhỡn chung, thế Zeta ζ tới hạn (cutoff) đối với dung dịch keo ổn định thường cú giỏ trị | ζ | > 30 mV, tại đú thế cú giỏ trị lớn hơn cú nghĩa là dung dịch cú độ ổn định lớn chống lại sự kết bụng và sa lắng [67,168].
Cỏc hạt silica được tổng hợp cú
thể được phõn tỏn tốt mà khụng cú bất kỳ sự kết đỏm nào do cú lớp điện tớch õm lớn trờn bề mặt được cung cấp bởi cỏc nhúm silanol (Si–OH hay Si–O-
).
Tuy nhiờn, cỏc nhúm chức năng trờn bề mặt hạt, cỏc lớp bọc tương thớch sinh học, pH hoặc nồng độ của dung dịch đệm thay đổi cú thể làm kết đỏm cỏc hạt lại với nhau. Cỏc đại phõn tử sinh học cũng cú thể ảnh hưởng tới tớnh ổn định, đặc biệt nếu chỳng đủ lớn để hấp phụ trờn bề mặt của cỏc hạt. Trờn cơ sở cỏc phộp đo thế Zeta, ta cú thể kiểm tra được phản ứng hợp sinh (gắn kết sinh học) đó được thực hiện hay chưa. Vớ dụ, giỏ trị thế Zeta sẽ thay đổi nếu một phõn tử được gắn vào hạt
Hỡnh 1.11. Biểu diễn thế Zeta của một
làm che cỏc điện tớch trờn bề mặt của hạt (trong trường hợp của protein) hoặc nếu tự phõn tử đú mang điện tớch đỏng kể (trong trường hợp của DNA) [67,168].
1.2.5. Cỏc hạt nano silica hợp sinh
1.2.5.1. Yờu cầu của cỏc hạt nano silica hợp sinh
Để cỏc hạt nano núi chung và hạt nano silica cú thể ứng dụng trong sinh học