Bảng 2.5: Chỉ tiêu sinh học sinh sản của keo tam bội được nghiên cứu
TT Dòng Ký hiệu
Địa điểm theo dõi
Các chỉ tiêu được đánh giá liên quan đến khả năng bất thụ Các chỉ tiêu đánh giá cho cây hậu thế của các dòng Đánh giá tổng thể cả
cây Các chỉ tiêu về hình thái
hoa
Bất dục tính đực Bất dục tính cái Hình thái/sinh trưởng
Độ bội thể Mức độ ra hoa (điểm) Mức độ đậu quả (điểm) Tỷ lệ hoa đực/bông (%) Tỷ lệ nảy mầm của hạt phấn (%) Tỷ lệ đậu quả và kết hạt (%) Tỷ lệ sống của hạt và cây hậu thế (%) Vườn ươm Ngoài rừng
A Các dòng keo tam bội
1 X01 MA XL + + + + + + - - - - 2 X11 MA XL và ĐP + + + + + + - - - - 3 X41 Aa XL và ĐP + + + + + + - - - - 4 X42 Aa XL và ĐP + + + + + + - - - - 5 X101 AM XL và ĐP + + + + + + - - - - 6 X102 AM XL và ĐP + + + + + + - - - - 7 X201 AM XL và ĐP + + + + + + + + + + 8 X202 AM ĐP + + + + + + - - - - 9 X204 AM XL và ĐP + + + + + + - - - - 10 X205 AM XL và ĐP + + + + + + - - - - 11 X1100 MA* XL + + + - - - - - - - 12 X1200 MA* XL + + + - - - - - - - 13 X1201 MA* XL + + + - - - - - - -
B Keo lai, Keo lá tràm nhị bội (đối chứng)
1 BV73 - XL + + + - - - - - - -
2 BV33 - ĐP + + + + + + + + - -
3 Clt18 - ĐP + + + + + + - - - -
AM = Keo lá tràm 2x × Keo tai tượng 4x; MA = Keo tai tượng 4x × hạt phấn tự do; MA* = Keo lai 2x × keo lai 4x; Aa = Từ Keo lá tràm 2x tự thụ phấn; XL = Xuân Lộc (Đồng Nai); ĐP = Đồng Phú (Bình Phước); (+) = đánh giá, (-) không đánh giá/không có vật liệu để đánh giá.
Các chỉ tiêu nghiên cứu về tính bất thụ cua keo tam bội tại 2 địa điểm nghiên cứu được thể hiện ở Bảng 2.5. Phương pháp nghiên cứu cụ thể cho mỗi chỉ tiêu được thực hiện như sau:
a) Nghiên cứu về đặc điểm hình thái hoa
Nghiên cứu đặc điểm hình thái hoa được thực hiện theo phương pháp của Sedgley và cộng sự (1992) [114].Cách thực hiện như sau: (1) Chọn 3 cây trong số những cây đã được chọn để quan sát mức độ ra hoa ở trên để thu mẫu hoa; (2) Thu 20 bông đại diện/cây ở khoảng giữa của tán cây, theo 4 hướng chính (5 bông/hướng). Hoa thu được bảo quản cẩn thận trong ống falcon có nắp kín và được để trong thùng đá nhằm tránh cho hoa bị héo; (3) Quan sát, đo đếm hoa được thực hiện trong phòng thí nghiệm, các chỉ tiêu bao gồm: màu sắc, chiều dài bông, tổng số hoa/bông, số hoa đực/bông. Màu sắc hoa được quan sát bằng mắt thường. Chiều dài bông được đo bằng thước kẻ, có độ chính xác là 1 mm. Hoa đực, hoa cái được quan sát bằng kính lúp.
Hình 2.7: Hoa của Keo lá tràm (màu vàng) và keo lai (màu vàng kem)
b) Đánh giá về mức độ ra hoa, đậu quả
Mức độ ra hoa, đậu quả được đánh giá bằng hình thức cho điểm, dựa theo phương pháp của Sedgley và cộng sự (1992) [114]. Theo đó, mỗi dòng chọn 10 cây đại diện (có sinh trưởng ở mức trung bình trở lên, tán cây phát triển cân đối, không bị sâu bệnh) để quan sát. Thời gian theo dõi từ tháng 8 đến tháng
4 năm sau (mùa hoa quả chính). Mức độ ra hoa, quả được đánh giá bằng hình thức cho điểm, với 4 mức như sau:
(0) không ra hoa, quả
(1) < 1/3 tán cây có hoa, quả (2) 1/3 – 2/3 tán cây có hoa, quả (3) > 2/3 tán cây có hoa, quả.
c) Đánh giá chất lượng hạt
Chất lượng hạt ở đây được đánh giá dựa vào đặc điểm hình thái, kích thước (dài, rộng) và trọng lượng. Cách tiến hành như sau: (1) Quả sau khi được thu về được để trong phòng 2 – 3 ngày cho chín đều, sau đó tiến hành bóc tách để thống kê số hạt/quả, phân loại hạt (chắc, lép). Mỗi hạt được đặt cho 1 mã số để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo; (2) Đo kích thước (dài, rộng) bằng thước kẹp điện tử có độ chính xác tới 0,01 mm; (3) Cân trọng lượng hạt bằng cân điện tử có độ chính xác tới 0,01 g
d) Xác định tỷ lệ nảy mầm của hạt phấn
Tỷ lệ nảy mầm hạt phấn được xác định trên môi trường agar theo các bước sau: (1) Thu hoa vào đầu buổi sáng, sau đó được làm khô bằng silica gel đến khi hạt phấn có thể bung ra (khoảng 3 giờ đồng hồ), theo dõi thường xuyên không để phấn khô quá ảnh hưởng tới tỷ lệ nảy mầm; (2) Hạt phấn được sàng lên môi trường agar: 1% agar + 20% đường sucrose + 0,01% axít boric (Lê Đình Khả, 2006) [12] và để ở điều kiện nhiệt độ phòng; (3) Sau 4 giờ tiến hành quan sát theo định kỳ 1 giờ/lần bằng kính hiển vi quang học cho đến khi không còn hạt phấn nảy mầm nữa thì dừng lại. Hạt phấn được cho là nảy mầm khi chiều dài ống phấn lớn hơn đường kính hạt phấn. Mỗi dòng quan sát 3 cây, mỗi cây quan sát 3 mẫu “đĩa”, mỗi đĩa quan sát 300 hạt phấn.
e) Xác định tỷ lệ đậu quả
Tỷ lệ đậu quả của được xác định dựa vào phương pháp của Sedgley và cộng sự (1992) [115] như sau: (1) Trên những cây đã được chọn để thu mẫu
hoa ở trên, tiến hành treo nhãn và đánh dấu cành để theo dõi tỷ lệ đậu quả. Cành hoa được chọn ở khoảng giữa của tán cây, phân bố tương đối đều theo 4 hướng chính; (2) Tiến hành đếm tổng số bông hoa/cành được treo nhãn. Số cành đánh dấu/cây là không giống nhau giữa các cây, tuy nhiên phải đảm bảo tối thiểu phải đạt 2.000 bông/cây; (3) Đến thời điểm quả chín rộ, tiến hành thu quả. Quả được thu riêng rẽ, quả trong phạm vi treo nhãn được để riêng để ước tính tỷ lệ đậu quả. Những quả ngoài phạm vi treo nhãn vẫn được thu để phục vụ cho các nghiên cứu khác.
f) Đánh giá khả năng phát triển của hậu thế keo tam bội
Khả năng phát triển của hậu thế keo tam bội được đánh giá dựa vào khả năng nảy mầm của hạt, tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây trong giai đoạn vườn ươm và ngoài rừng. Các bước thực hiện như sau:
(i) Xác định tỷ lệ nảy mầm của hạt: Toàn bộ số hạt của dòng keo tam bội X201 thu được được xử lý nảy mầm bằng nước sôi theo phương pháp của (Gan và Liang, 1992) [53]. Sau đó, hạt được rửa lại bằng nước sạch và gieo trên đĩa petri được lót giấy thấm giữ ẩm để trong tối ở nhiệt độ phòng. Hạt được kiểm tra mỗi ngày đảm bảo các điều kiện nảy mầm tốt nhất. Tiến hành thống kê số hạt nẩy mầm để tính tỷ lệ nảy mầm của hạt. Nội dung này được thực hiện cho toàn bộ số hạt thu được trên cây (kể cả những quả không nằm trong phạm vi được treo nhãn). Trong suốt thời gian theo dõi, mã số của hạt luôn được duy trì để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
(ii) Đánh giá khả sinh trưởng của cây con hậu thế: Toàn bộ số hạt nảy mầm được đem đi cấy trực tiếp vào bầu đất (89% đất tầng mặt + 9% phân xơ dừa + 1% phân chuồng hoai). Sau đó, tiến hành đánh giá tỷ lệ sống của cây con sau 3 tháng tuổi. Những cây còn sống sau 3 tháng được đem đi trồng ngoài hiện trường rừng để đánh giá khả năng sinh trưởng của chúng trong môi trường tự nhiên. Tỷ lệ sống, quan sát hình thái, đánh giá tình hình sinh trưởng của cây sau 12 tháng tuổi.
g) Xác định mức độ bội thể của hậu thế tam bội
Mức độ bội thể được xác định theo phương pháp tế bào dòng chảy (flow cytometry- FCM) và được thực hiện bằng máy CyFlow Ploidy Analyzer (Partec, Munster, Germany) dựa vào phương pháp của Harbard và cộng sự (2012) [66] đã phát triển riêng cho nhóm loài keo. Các bước tiến hành như sau: (i) Chuẩn bị mẫu, lá tươi (≈ 1 cm2/mẫu) của cây cần phân tích và lá đậu Hà Lan (Pisum vativum) (2n = 2x = 14, lượng DNA trong nhân = 9.10 pg, làm đối chứng) được băm nhỏ trên khay đá (15 mg lá tươi/mẫu) và trộn với dung dịch đệm Woody Plant Buffer bổ sung 3% PVP-10 (WPB2). Bổ sung thêm 200 µl WP2 trước khi lọc qua phễu lọc Celtric@ filter, kích thước lỗ màng lọc 20 µm. Bổ sung thêm 1,6 ml dung dịch nhuộm có chứa 4',6-diamidino-2- phenylindole (DAPI) (the Cystain® DAPI Precise P Kit, Partec - Munster, Germany) ủ trong 2 phút.
(ii) Phân tích dung dịch mẫu bằng máy phát huỳnh quang đã điều chỉnh các thông số kỹ thuật DNA-DAPI: L-L030, tốc độ 0,4 µl/phút và Gain ≈ 650. (iii) Xác định độ bội thể thông qua tỷ số giữa giá trị tần số quang phổ của mẫu/giá trị tần số quang phổ của đậu (Hình 2.8).
Hình 2.8: Biểu đồ tần số dòng chảy tế bào của mẫu cùng đối chứng (đậu Hà lan - Pisum sativum var. Torstag)