2.4.8.1. Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
Luận văn tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của tinh dầu hạt ngò và bã cao chiết hạt ngò trên các chủng vi khuẩn sau:[40-45]
Bảng 2.3: Các chủng vi khuẩn dùng trong luận văn
Tên vi khuẩn Gram Đặc điểm Gây bệnh Nơi thường gặp nhất
Enterococcus faecalis ATCC
29212 (+)
Hình cầu, không di chuyển, quan sát được
đơn lẻ, theo cặp hoặc
trong chuỗi xoắn Nhiễm trùng
Ruột già của người
Staphylococcus aureus ATCC
29213
(+)
Là cầu khuẩn, không sinh bào tử, không di động, xếp thành chùm
đôi hoặc chuỗi, ít khi đứng riêng lẻ.
Mụn nhọt, viêm da, viêm phổi, viêm màng não,
viêm nội mạc của tim
34
Escherichia coli ATCC 25922 (E.
coli)
(-) Trực khuẩn ngắn, hình que, có lông nên di
động được
Tiêu chảy Ruột người và gia súc
Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853 (-)
Trực khuẩn hình que, có đơn mao ở một đầu,
tồn tại ở dạng đơn, bắt cặp hoặc tạo chuỗi ngắn, có khả năng di
chuyển một cực
Gây viêm có mủ xanh, nhiễm
trùng huyết Nơi ẩm ướt
Methicillin – resistant Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) (+) Là vi khuẩn Staphylococus aureus kháng nhóm methicillin
Viêm da, viêm phổi, viêm màng não và kháng kháng sinh Da, tay Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 14028 (-) Trực khuẩn, thuộc họ Enterobacteriaceae, có
lông roi. Thương hàn
Thực phẩm nhiễm khuẩn
Môi trường sử dụng
Môi trường hoạt hóa vi khuẩn thử nghiệm: Tryptic Soy Broth (TSB). Môi trường giữ giống vi khuẩn: Tryptic Soy Agar (TSA).
Môi trường thử nghiệm khả năng kháng khuẩn: Mueller Hinton Agar (MHA).
Lưu ý
Môi trường MHA và TSA có dạng bột khô, khi sử dụng phải hòa tan trong nước theo hướng dẫn trên bao bì và nấu chảy cho thạch tan hoàn toàn. Tiệt trùng môi trường ờ nhiệt độ 121 oC, áp suất 1 atm trong nồi hấp tự động. Sau đó đổ đĩa sao cho lớp thạch dày khoảng 3 – 4 mm. Nếu bề mặt thạch đọng nước cần hong khô trong tủ cấy. Thao tác
35
được thực hiện trong tủ cấy. Môi trường TSB cũng được chuẩn bị như môi trường MHA và TSA nhưng không cần đun sôi. Môi trường đã pha nhưng chưa sử dụng được bảo quản trong tủ lạnh 4oC gói kín để tránh mất nước. Khi lấy từ tủ lạnh ra, môi trường cần được để ráo nước trước khi tiến hành thao tác.
Phương pháp khuếch tán trong thạch:
Nguyên tắc: vi sinh vật được trải trên bề mặt môi trường, kháng sinh tẩm trong đĩa giấy
hay từ ống hình trụ đặt trên môi trường, đục lỗ trong môi trường sẽ khuếch tán ra và ức chế vi sinh vật tạo thành vùng ức chế, mức độ nhạy cảm cuả vi sinh vật với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính các vòng ức chế. Đường kính này tỷ lệ nghịch với MIC của kháng sinh khảo sát.
Lưu ý rằng đường kính vòng ức chế lớn không có nghĩa là MIC thấp vì đường kính này còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như khả năng khuếch tán của chất thử, độ dày của lớp thạch, độ đặc của thạch, nồng độ chất thử, nhiệt độ, pH...
Chuẩn bị:
Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm
Cấy ria vi khuẩn thử nghiệm trên môi trường thạch TSA, ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Lấy 2 khuẩn lạc riêng lẻ cấy vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường TSB.
Ủ ở 37 oC trong 2 – 6 giờ để hoạt hóa vi khuẩn.
Điều chỉnh độ đục bằng cách pha loãng với nước muối sinh lý hoặc môi trường TSB sao cho mật độ vi khuẩn thu được với độ đục tại bước sóng 625 nm là 0,1 tương đương khoảng 1 – 2x108 CFU/ml (CFU: colony forming unit).
Chất thử: tinh dầu quả ngò pha loãng tỉ lệ 1/2. Chất chứng: Gentamicin.
Tiến hành:
Môi trường MHA hòa tan vào nước, thêm agar nấu chảy cho thạch tan hoàn toàn. Sau đó, được hấp tiệt trùng ở 121 oC và rót vào đĩa petri (mỗi đĩa 20 ml môi trường). Để nguội cho thạch đông lại.
Trải đều 200 μl vi khuẩn lên bề mặt thạch.
36
Dùng ống inox có đường kính 8 mm đục lỗ trên đĩa thạch.
Dùng micropipette hút 50 µl chất thử vào giếng và đồng thời tiến hành song song với giếng đối chứng 50 µl gentamicin 0,5 mg/ml.
Để yên khoảng 15 phút cho các chất thử khuếch tán vào lớp thạch. Ủ các đĩa petri trong tủ ấm 37 oC trong 18 – 24 giờ.
Hình 2.3: Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
Đọc kết quả: Đo và ghi nhận đường kính vòng kháng khuẩn bằng milimet, đường kính
vòng kháng khuẩn được xác định là giá trị trung bình của ít nhất ba lần thí nghiệm lặp lại.
2.4.8.2. Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa
Quy trình đánh giá khả năng kháng oxy hóa được thực hiện theo phương pháp của Brand-Williams và các cộng sự (năm 1995) và thay đổi một số cho thích hợp. [46]
Nguyên tắc:
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là hợp chất có màu tím được phát hiện ở bước sóng 517 nm. Khi các điện tử lẻ của các gốc tự do DPPH kết hợp với hydro từ chất chống oxy hóa thì sẽ hình thành nên DPPH–H lúc này màu sắc chuyển từ màu tím sang màu vàng. Sự biến đổi màu này tương ứng với lượng electron kết hợp với DPPH. Do đó, khả năng làm sạch gốc tự do của một chất càng cao thì sự hấp thu quang phổ được đo ở 517 nm của phản ứng DPPH có giá trị càng giảm và ngược lại. Thông qua việc so sánh độ hấp thu của mẫu cao với mẫu trắng, có thể xác định được lượng gốc tự
37
do DPPH đã bị bắt
Hình 2.4: Phản ứng của gốc tự do DPPH và chất chống oxy hóa
Cách tiến hành
Chuẩn bị dung dịch DPPH 30 μg/mL trong methanol 80% sao cho OD = 0.7 ± 0.2 Chuẩn bị dung dịch cao chiết (cao tổng ethanol, cao tổng nước và các
cao thành phần) ở nồng độ từ 0 – 5000 μg/mL
Mẫu chứng dương vitamin C được chuẩn bị ở nồng độ 0 - 10μg/mL trong methanol 80%
Cách tiến hành: cho 120 μL dung dịch cao chiết vào 180 μL dung dịch DPPH, lắc đều và ủ 30 phút trong tối ở nhiệt độ phòng. Đo mật độ quang ở bước sóng 517 nm
Mẫu trắng được thực hiện với 120 μL methanol 80% và 180 μL dung dịch DPPH Chứng dương được thực hiện với 120 μL vitamin C và 180 μL dung dịch DPPH Mẫu đo màu của cao chiết được thực hiện với 120 μL dung dịch cao chiết
và 180 μL methanol 80%.
Tỷ lệ bắt gốc tự do DPPH được tính theo công thức: Tỷ lệ bắt gốc DPPH (%)= 𝐴𝑐−(𝐴𝑠−𝐴𝑏)
𝐴𝑐 × 100% Trong đó:
Ab: mật độ quang của mẫu trắng ( độ hấp thu mẫu Blank ). As: mật độ quang của mẫu ( độ hấp thu của mẫu ).
Ac: mật độ quang màu của cao ( độ hấp thu màu ban đầu của cao chiết ).
2.4.8.3. Phương pháp đo hoạt tính kháng viêm
Hoạt tính kháng viêm được thực hiện theo phương pháp in vitro ức chế sự biến tính protein của Arif Ullah và cộng sự (2014).[47]
Nguyên tắc:
38
viêm là một quá trình phức tạp, thường liên quan đến sự xuất hiện của sự gia tăng thẩm thấu qua mạch, tăng sự biến tính protein và thay đổi màng tế bào. Nếu viêm không được điều trị kịp thời sẽ dẫn đến các biến chứng khác nguy hiểm hơn. Phương pháp đánh giá khả năng kháng viêm in-vitro hoạt động theo cơ chế: mẫu sẽ làm giảm sự biến tính protein khi protein chịu các tác động nhiệt bất ngờ. Protein khi bị biến tính sẽ tạo độ đục cao. Thông qua đó có thể đánh giá khả năng kháng viêm bằng cách đo độ hấp thu của dung dịch sau phản ứng ở bước sóng tối ưu theo nghiên cứu là 660 nm.
Phương pháp đánh giá khả năng kháng viêm in vitro có những ưu điểm nhất định so với phương pháp kháng viêm in vivo, đó là tốc độ phản ứng nhanh hơn và giá thành rẻ hơn, phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm nhỏ.[48][49]
Cách tiến hành
Chuẩn bị hỗn hợp 1 ml bao gồm 0,5 ml albumin trứng 5% pha trong đệm pH=6,4 0,5 ml dịch chiết được pha trong DMSO 5% có nồng độ thay đổi sao cho nồng độ trong hỗn hợp cuối cùng là 100, 200, 400, 500 𝜇g/ml. Mẫu kiểm soát làm tương tự nhưng thay dịch chiết bằng DMSO 5%. Mẫu màu làm tương tự mẫu test nhưng thay albumin 5% bằng đệm.
Hỗn hợp được ủ bằng máy ủ BOD trong 15 phút ở nhiệt độ 37 oC, sau đó được gia nhiệt lên 70 oC trong 5 phút. Làm nguội và đo bước sóng hấp thu tại l = 660 nm Indomethacin được xử lí tương tự với nồng độ 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700,
39
Hình 2.5: Quy trình đánh giá hoạt tính kháng viêm
Phần trăm ức chế sự biến tính protein được tính theo công thức sau: %𝐼 = 𝐴𝑏 − ( 𝐴𝑡 − 𝐴𝑐 )
Ab Trong đó:
Ab: độ hấp thu của mẫu trắng At: độ hấp thu của mẫu
Ac: độ hấp thu của mẫu màu