Năm 2019, Nguyễn Thị Yến đã nghiền cứu bào chế nano FB bằng phương pháp nghiền bi với thành phần gồm 1 g FB; 0,5 g inulin; 0,5 g Gelot 6; 20 ml dung dịch gôm
Tên nghiên cứu Phương pháp chiết Kết quả
Xây dựng phương pháp định lượng acid fenofibric trong
huyết tương bằng HPLC [10]. Kết tủa protein
LOQ: 0,25µg/ml
Khoảng tuyến tính: 0,25- 50 µg/ml
RSD ≤ 5% Xây dựng phương pháp định
lượng fenofibrat và acid fenofibric trong huyết tương chó phục vụ xác định các thông số được động học viên nang fenofibrat 160mg [12]. Chiết lỏng- lỏng LOQ: 0,1µg/ml Khoảng tuyến tính: 0,1- 50 µg/ml RSD ≤ 15% Ứng dụng: xây dựng mô hình dược động học của viên nang fenofibrat 160mg.
Xây dựng phương pháp định lượng fenofibrat và acid fenofibric trong huyết tương chó bằng HPLC [9]. Chiết lỏng- lỏng LOQ: 0,2µg/ml Khoảng tuyến tính: 0,25- 50 µg/ml RSD ≤ 6,7%
16
Arabic 8%; 250 g bi (125 g bi 10 mm, 125 g bi 11,5 mm). Sau 2h nghiền thu được tiểu phân kích thước khoảng 560 nm, PDI khoảng 0,2; hiệu suất nano hóa xấp xỉ 100%, tỷ lệ dược chất nano 22,96%, bột thu được sau khi rắn hóa với chất mang calci silicat có độ hòa tan trên 80% sau 30 phút theo chuyên luận viên nén FB của USP 41 [11].
Năm 2015, Mohammad Azad và cộng sự đã bào chế thành công hệ tiểu phân nanofenofibrat bằng phương pháp nghiền bi với hỗn hợp chất ổn định là HPMC 1%, SDS 0.075%, Crospovidon 1%, kết quả cho tiểu phân nano fenofibrat có kích thước <250nm, và kích thước gần như không thay đổi sau 7 ngày [15].
Năm 2010, Zhang L. và cộng sự công bố kết quả nghiên cứu bào chế vi hạt và siêu vi hạt FB bằng phương pháp nghiền ướt với các polyme thân nước. Viên nén được bào chế từ vi hạt tạo ra giải phóng dược chất hoàn toàn sau 30 phút, tương đương viên Lipanthyl Supra 160 mg. Kết quả đánh giá sinh khả dụng trên chó cho thấy thuốc nghiên cứu có sinh khả dụng cao hơn viên Lipanthyl Supra 160 mg 1,3 lần và thời gian đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương ngắn hơn (2,63 giờ so với 3,75 giờ ở viên đối chứng) [56].
Năm 2012, P. Wang và cộng sự đã bào chế thành công tiểu phân nano fenofibrat bằng phương pháp nghiền ướt. Rắn hoá hỗn dịch nghiền bằng thiết bị tầng sôi thu được pellet đạt tương đương hoà tan với viên nang Antara 130 mg trong môi trường 0,01M NaLS. Kết quả đánh giá sinh khả dụng trên chó cho thấy thuốc nghiên cứu có sinh khả dụng cao hơn viên Antara 130 mg 1,2 lần và thời gian đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương ngắn hơn (2,0 giờ so với 6,89 giờ ở viên đối chứng) [54].
Năm 2015, C. Knieke và cộng sự đã bào chế cốm chứa tiểu phân nano fenofibrat bằng phương pháp nghiền ướt và phun sấy trên thiết bị tầng sôi. Đầu tiên, hỗn dịch nano fenofibrat được chuẩn bị bằng phương pháp nghiền ướt, phun hỗn dịch thu được lên trên nhân lactose bằng thiết bị tầng sôi. Cốm thu được có khả năng tái phân tán tốt và hoà tan hoàn toàn sau 10 phút ở môi trường NaLS 0,025M [27].
17
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
Bảng 2.1. Các nguyên liệu dùng trong thực nghiệm
STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn
1 Fenofibrat* Trung Quốc BP 2020
2 Hydroxy propyl cellulose Ashland (Mỹ) EP 10.0 3 Hydroxypropyl methyl cellulose E6 Colorcon (Trung Quốc) USP 43 4 Manitol Pháp EP 10.0
5 Saccharose Việt Nam DĐVN V
6 Natri lauryl sulfat Trung Quốc USP 43
7 SuperTab 11SD ** DFE pharma (India) USP 41
8 Natri croscarmellose Ireland USP 43
9 Magnesi stearat Ấn Độ BP 2020
10 Microcrystalline cellulose PH102
Ấn Độ BP 2020
11 Opadry amb II white Colorcon (Trung Quốc)
TC NSX
12 Nước tinh khiết Việt Nam DĐVN 5
13 Fenofibric chuẩn Mĩ USP
14 Atorvastatin Ca Việt Nam VKNTTW
15 Methanol Đức USP 43
16 Acetonitril Đức USP 43
17 Acid Phosphoric 85% Tây Ban Nha USP 43
Chú thích:
* Hàm lượng 99,8%, D90 ≤20µm
** Phân bố kích thước tiểu phân: không nhiều hơn 20% nhân nhỏ hơn 63 µm, không ít hơn 95% nhân nhỏ hơn 220 µm.
2.1.2. Thiết bị
18
- Máy nghiền bi Tencan XQM- 2A (Trung Quốc) - Máy dập viên quay tròn SHAKTI (Ấn Độ)
- Máy khuấy từ WiseStir ® MSH 20A (Hàn Quốc) - Máy đo độ trơn chảy của hạt Erweka, GTL (Đức) - Hệ thống thử hòa tan Pharmatest (Đức)
- Máy đo quang phổ UV – VIS OPTIMA SP – 3000 (Nhật) - Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC SHIMADZU (Nhật) - Máy li tâm lạnh siêu tốc Hermle Z326K (Đức)
- Máy đo thế zeta và xác định phân bố kích thước tiểu phân Zetasizer NanoZS90 Malvern (Anh)
- Máy trộn lập phương ERWEKA (Đức)
- Máy bao phim tự động SHAKTI LABCOAT M1 (Ấn Độ) - Máy lắc Votex (Mỹ)
2.1.3. Viên đối chiếu
- Viên nén bao phim Lypanthyl 145mg (Abbott), số lô: 02976, hạn dùng: 29/09/2022.
- Thành phần: fenofibrat 145 mg, hypromellose, natri docusate, sucrose, natri lauryl sulfat, lactose monohydrat, microcrystallin cellulose, colloidal silica anhydrous, crospovidon, magnesi stearat, Opadry® (polyvinylic alcohol, titan dioxyd (E171), talc, lecithin dầu đậu nành, gôm xanthan)
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Xây dựng công thức bào chế viên nén chứa nano fenofibrat 145 mg ở quy mô 1000 viên/lô: Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố công thức và quá trình 1000 viên/lô: Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố công thức và quá trình
2.2.2. Đề xuất tiêu chuẩn viên nén fenofibrat 145mg và cốm fenofibrat thu được 2.2.3. Đánh giá sinh khả dụng của viên nén fenofibrat 145mg thu được so sánh với 2.2.3. Đánh giá sinh khả dụng của viên nén fenofibrat 145mg thu được so sánh với viên đối chiếu ở in vivo.
19
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp bào chế viên nén fenofibrat 145mg
Hình 1.3. Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn bào chế viên nén fenofibrat 145mg quy mô 1.000 viên/ lô.
Bào chế viên nén FB theo các giai đoạn như sơ đồ trên, chi tiết phương pháp bào chế như sau:
Chuẩn bị:
Các nguyên liệu phải được kiểm nghiệm và đạt các tiêu chuẩn như ở bảng 2.1 Các thiết bị, dụng cụ được vệ sinh sạch sẽ, khô và sạch trước khi bào chế.
Các giai đoạn pha chế:
2.3.1.1. Giai đoạn 1: Bào chế hỗn dịch Fenofibrat
Công thức cho 1 mẻ nghiền 300 ml/ 4 cối hỗn dịch Fenofibrat
Bảng 2.2. Công thức cho 1 mẻ nghiền 300 ml/ 4 cối hỗn dịch Fenofibrat
Thành phần KL 1 cối KL 4 cối
Fenofibrat 22,5 g 90 g
HPMC E6 1,125g 4,5 g
20
DOSS 0,06 g 0,24 g
Nước tinh khiết 75 ml 300 ml
- Cân dược chất (90g FB) và TD theo tỉ lệ đã định.
- Chuẩn bị dung dịch chất ổn định: hoà tan hoặc ngâm trương nở polyme (gồm HPMC E6 và HPC) vào trong 270 ml nước
- Hoà tan 0,24g Natri Docusat (DOSS) bằng 30 ml nước sôi.
- Phối hợp dược chất với các dung dịch chất ổn định thu được hỗn dịch chứa tiểu phân micro fenofibrat.
- Nghiền ướt bằng thiết bị nghiền bi với các thông số thiết bị nghiền bi XQM- 2A như sau:
Số lượng cối nghiền: 4 cối
Tần số: 500rpm
Khối lượng bi: 500 g bi/ cối làm từ vật liệu Ziconic kích thước 5mm.
Thời gian nghiền: 5 giờ
Chu kì nghiền: 1 giờ- nghỉ 10 phút.
- Thu hỗn dịch chứa tiểu phân nano fenofibrat, lọc qua rây 0,18mm.
2.3.1.2. Giai đoạn 2: Rắn hóa hỗn dịch chứa tiểu phân nano fenofibrat bằng phương pháp tạo hạt sử dụng máy bao tầng sôi Mini Glatt
Công thức dịch phun cho quá trình tạo hạt
Bảng 2.3. Công thức dịch phun cho quá trình tạo hạt
1 cối nghiền 4 cối nghiền Công thức dịch nghiền Fenofibrat (g) 22,5 90 HPC (g) 0,75 3,0 HPMC E6 (g) 1,125 5 DOSS (g) 0,06 0,24
Nước tinh khiết (ml) 75 300 TD thêm vào dịch
nghiền
Manitol (g) 22,5 45
DOSS (g) 0,42 1,68
HPMC E6 (g) 1,125 5
Khối lượng nhân trơ
SuperTab 11SD (g) 30 120
Tiến hành:
- Cân khối lượng hỗn hợp TD thêm vào theo công thức. - Pha dung dịch HPMC E6 10%: phân tán
21
- Hỗn dịch nghiền thu được từ mỗi mẻ nghiền thêm các thành phần TD giúp ổn định, tăng thấm vào dịch nghiền, tiến hành tạo hạt.
- Cân 120 g SuperTab 11SD cho khối lượng hỗn dịch nano chứa tương đương 90g fenofibrat
- Cho nhân trơ vào trong máy, sấy đến khi đạt nhiệt độ khoảng 10 phút, tiến hành tạo hạt theo thông số tạo hạt thích hợp.
- Thông số quá trình tạo hạt:
Nhiệt độ đầu vào: 60o C
Nhiệt độ sản phẩm: 37- 40oC (có thể thay đổi tuỳ theo khả năng tạo hạt)
Lưu lượng khí đầu vào: 15- 20 m3/giờ
Áp súng súng phun: 1,2- 1,5 bar
Đường kính vòi phun: 0,3 mm
Tốc độ phun dịch: 70 -90 ml/ giờ (có thể thay đổi tuỳ theo khả năng tạo hạt)
- Sau khi tạo hạt xong, sấy cốm thu được thêm 10 phút để cốm về nhiệt độ thường, lấy cốm để trong bình hút ẩm 24 giờ để cốm ốn định.
2.3.1.3. Giai đoạn 3: Bào chế viên nén bao phim chứa tiểu phân nano fenofibrat
- Hạt thu được theo phương pháp trên đạt yêu cầu sẽ được trộn TD theo công thức bằng thiết bị trộn lập phương ERWEKA, tốc độ 30 vòng/ phút, thời gian trộn là 7 phút
- Lấy mẫu để kiểm tra.
- Sau đó dập viên theo bằng phương pháp dập thẳng trên máy dập viên quay tròn SHAKTI. Sử dụng chày hình oval, chày lõm, độ cứng 7-9 Kp, khối lượng viên 640mg.
- Tiến hành bao phim trên thiết bị SHAKI LABCOAT, với thông số quá trình bao phim như sau:
Nhiệt độ khí vào: 700C
Nhiệt độ sản phẩm: 35-400C
Lưu lượng khí vào: 80%
22
Tốc độ lồng bao: 10 vòng/phút
Tốc độ cấp dịch: 20 vòng/phút
Áp lực khí phun: 1 bar
2.3.2. Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng tiểu phân nano fenofibrat
2.3.2.1. Đánh giá kích thước tiểu phân trung bình (KTTP) và phân bố kích thước tiểu phân (PDI)
Nguyên tắc xác định KTTP: KTTP xác định bằng phương pháp tán xạ laser. Chiếu một chùm tia laser vào hỗn dịch chứa các tiểu phân có kích thước khác nhau sẽ thu được mức độ tán xạ ánh sáng khác nhau. Bằng cách đo cường độ tán xạ có thể xác định được KTTP trung bình.
Tiến hành: Mẫu sau khi li tâm 1000 rpm trong 10 phút được pha loãng bằng một lượng nước thích hợp đã lọc qua màng lọc cellulose 0,2 µm để tránh hiện tượng đa tán xạ. Tốc độ đếm tiểu phân (count rate) nằm trong khoảng 200-400 kcps. Tiến hành đo mẫu trên máy quang phổ photon ánh sáng Zetasizer Nano ZS90 ở nhiệt độ 25 ± 2ºC.
Đánh giá kết quả: Zaverage, PDI. Trong đó, chỉ số Zaverage (đơn vị đo “d. nm” là số nanomet đường kính tiểu phân) gần tương đương với KTTP trung bình của mẫu khi giá trị PDI nhỏ (0 - 0,3) và dùng để so sánh về kích thước giữa các mẫu niosome khác nhau. Khi PDI lớn (> 0,5) thì chỉ số Zaverage không có ý nghĩa, dựa vào vị trí của các peak trên đồ thị phân bố KTTP để so sánh kích thước giữa các mẫu [7].
2.3.2.2. Xác định hàm lượng dược chất trong hỗn dịch bào chế sau li tâm
Nguyên tắc: Sử dụng lực li tâm ở tốc độ thấp và thời gian ngắn để loại tinh thể KTTP lớn (micron), giữ lại tinh thể KTTP nhỏ hơn. Từ đó sơ bộ xác định được hàm lượng dược chất ở dạng nano trong hỗn dịch bào chế.
Tiến hành: Mẫu nghiền bi fenofibrat pha loãng bằng một lượng nước cất thích hợp đã lọc qua màng cellulose acetat 0,2 µm. Khuấy đều trong 5 phút để phân tán đều hỗn dịch.
Mẫu dược chất toàn phần: Lấy chính xác 1 ml hỗn dịch trên cho vào bình định mức thích hợp (𝐷𝑡𝑝- Độ pha loãng của mẫu toàn phần). Thêm 5 ml MeOH, đậy kín và siêu âm trong 10 phút. Bổ sung dd NaLS 0,72% vừa đủ đến vạch, lắc đều. Đo quang ở bước sóng 289 nm với mẫu trắng là dd NaLS 0,72%.
23
Mẫu hỗn dịch dược chất sau li tâm: Hút chính xác 10 ml hỗn dịch trên cho vào ống li tâm 14 ml và tiến hành li tâm ở tốc độ 1000 rpm trong 10 phút. Hút 1 ml dịch phía trên sau li tâm vào bình định mức thích hợp (𝐷𝑙𝑡 - Độ pha loãng của mẫu li tâm), bổ sung bằng dd NaLS 0,72% vừa đủ đến vạch, lắc đều để hòa tan. Đo quang ở bước sóng 289 nm.
Hàm lượng dược chất (HLDC) sau li tâm được tính bằng công thức sau: 𝐻𝐿𝐷𝐶 𝑠𝑎𝑢 𝑙𝑦 𝑡â𝑚 𝑥 𝑟𝑝𝑚 = 𝐴𝑙𝑡∗ 𝐷𝑙𝑡
𝐴𝑡𝑝∗ 𝐷𝑡𝑝∗ 100% Trong đó :
𝐷𝑙𝑡, 𝐷𝑡𝑝 là độ pha loãng của mẫu sau li tâm ở 1000 rpm và mẫu toàn phần. 𝐴𝑙𝑡, 𝐴𝑡𝑝 là mật độ quang của mẫu sau li tâm ở 1000 rpm và mẫu toàn phần.
2.3.3. Phương pháp đánh giá chất lượng cốm fenofibrat.
2.3.3.1. Xác định hàm lượng dược chất trong cốm sau khi phân tán và li tâm ở tốc độ 1000rpm.
Nguyên tắc: Tương tự như mục 2.3.2.2.
Tiến hành:
Mẫu trắng: dd NaLS 0,72%.
Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 10 mg FB vào bình định mức 100 ml. Hòa tan bằng 10 ml MeOH, siêu âm 10 phút cho tan hoàn toàn rồi bổ sung vừa đủ bằng dung dịch NaLS 0,72%. Pha loãng 10 lần bằng dd NaLS 0,72% và đo quang ở bước sóng 289 nm.
Mẫu thử: Cân chính xác lượng cốm/ bột viên chứng sau khi nghiền có chứa khoảng 10 mg FB vào ống li tâm 14 ml. Thêm chính xác 10 ml nước cất. Lắc trong 10 phút cho cốm phân tán đều rồi tiến hành li tâm ở tốc độ 1000rpm. Sau đó hút 1 ml dịch phía trên pha loãng vào bình định mức thích hợp (𝐷𝑙𝑡- Độ pha loãng của mẫu li tâm), bổ sung bằng dd NaLS 0,72% vừa đủ đến vạch, lắc đều để hòa tan. Đo quang ở bước sóng 289 nm với mẫu trắng là dd NaLS 0,72%.
Hàm lượng dược chất trong cốm sau khi phân tán và li tâm được tính bằng công thức sau:
𝐻𝐿𝐷𝐶 𝑠𝑎𝑢 𝑙𝑖 𝑡â𝑚 1000 𝑟𝑝𝑚 = 𝐴𝑙𝑡∗ 𝐷𝑙𝑡∗ 𝐶𝑐
24 Trong đó :
𝐷𝑙𝑡 là độ pha loãng của mẫu sau li tâm ở x rpm.
𝐴𝑙𝑡, 𝐴𝑐 là mật độ quang của mẫu sau li tâm ở 1000 rpm và mẫu chuẩn. 𝐶𝐶 là nồng độ của mẫu chuẩn (µg/ml).
𝑚𝑐ố𝑚 là khối lượng cân của mẫu cốm (g). HLDCTP là hàm lượng FB trong cốm (%)
Chỉ tiêu định lượng, độ hoà tan cốm Fenofibrat được xây dựng theo chuyên luận viên nén Fenofibrat Dược điển Mĩ 43 [44].
2.3.3.2. Định lượng
Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Chuẩn bị mẫu:
Nước acid hóa: Điều chỉnh nước cất đến pH 2,5 ± 0,1 bằng acid phosphoric đặc.
Pha động: Acetonitril – nước acid hóa (70 : 30).
Dung dịch chuẩn gốc: Pha dung dịch fenofibrat chuẩn trong pha động có nồng độ chính xác khoảng 0,5 mg/ml.
Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch fenofibrat chuẩn trong pha động có nồng độ chính xác khoảng 0,05 mg/ml.
Dung dịch thử gốc: Cân chính xác một lượng cốm tương ứng với 50 mg fenofibrat vào bình định mức 100 ml, thêm 30 ml nước acid hóa, lắc để phân tán đều. Thêm khoảng 50 ml acetonitril, lắc siêu âm 10 phút để hòa tan. Thêm acetonitril vừa đủ đến vạch. Lắc đều, lọc.
Dung dịch thử: Pha loãng 5,0 ml dung dịch thử gốc thành 50,0 ml bằng pha động.
Dung dịch thử độ thích hợp của hệ thống sắc ký: Cân khoảng 5,0 mg mỗi chuẩn fenofibrat tạp A và fenofibrat tạp B vào bình định mức 50,0 ml, hòa tan và pha loãng vừa đủ thể tích bằng acetonitril. Hút 1,0 ml dung dịch thu được vào bình định mức 200 ml, pha loãng vừa đủ bằng pha động để được dung dịch chứa 0,5 µg/ml mỗi chuẩn tạp A và tạp B.
Điều kiện sắc ký: Sử dụng cột sắc kí là Cột RP18, 250 x 4,6 mm, 5µm, duy trì ở 35°C, Detector UV ở bước sóng 286 nm. Tốc độ dòng: 1,2 ml/min. Thể tích tiêm: 10 µl.
25
Tiêm dung dịch thử độ thích hợp của hệ thống: độ phân giải giữa 2 pic tạp chất A và B của fenofibrat không ít hơn 2,0.
Tiêm dung dịch chuẩn: RSD% của diện tích pic fenofibrat từ 06 lần tiêm lặp lại không quá 2,0%.
Tiêm lần lượt dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Tính hàm lượng fenofibrat trong cốm dựa vào diện tích pic thu được từ dung dịch chuẩn, dung dịch thử và hàm lượng